Unser Protokoll kann verwendet werden, um die strukturelle Komplexität von Organoiden zu visualisieren und die Kartierung von Identität, Sulfat und Verteilung in diesen 3D-Strukturen in der einzelzelligen Auflösung zu ermöglichen. Unser schnelles Drei-Tage-Protokoll ist vollständig für Organoide unterschiedlichen Ursprungs optimiert und verwendet eine einfache Probenvorbereitung, die einen ungiftigen optischen Clearingschritt und ein Silizium-basiertes Montageverfahren umfasst. Obwohl unser Protokoll einfach ist, sind einige von ihnen wichtige Schritte wie die organisierte Handhabung oder die Folienvorbereitung, die besser durch visuelle Demonstration als durch Text erklärt werden können.
Um 100 bis 500 Mikrometer Durchmesser Organoide in Kellermembranextrakt in 24 Brunnenplatten gewachsen zu erholen, waschen Sie jede Schweißnaht mit PBS geerntet werden, ohne die 3D-Matrizen zu stören, und legen Sie die Platte auf Eis. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter eiskalte Erholungslösung hinzu und legen Sie die Platte 30 bis 60 Minuten lang auf einen horizontalen Shaker bei vier Grad Celsius. Tauchen Sie eine Milliliter Pipettenspitzen in eine 1%BSA in PBS-Lösung und Pipette zwei Mal nach oben und unten, um jede Spitze mit BSA zu beschichten.
Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter 1%PBS BSA zu einem 15 Milliliter Rohr pro Zustand hinzu und invertieren Sie das Rohr zwei- bis dreimal, bevor Sie die Lösung entsorgen, um die Innenseite des Rohres zu beschichten. Um die Organoide zu sammeln, verwenden Sie eine beschichtete Spitze, um den Brunneninhalt fünf- bis zehnmal sanft wieder aufzuhängen, und ziehen Sie alle Organoide aus jedem Zustand in einem einzigen beschichteten 15-Milliliter-Rohr. Spülen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter eiskalte1%PBS BSA, um sicherzustellen, dass alle Organoide gesammelt wurden, und übertragen Sie die Waschungen in die entsprechenden Röhren.
Bringen Sie das endige Volumen in jede Röhre bis zu 10 Milliliter mit kaltem PBS und sedimentieren Sie die Organoide durch Zentrifugation, um eine enge Palette ohne eine sichtbare Schicht 3D-Matrix zu erhalten. Um die Organoide zu fixieren, verwenden Sie eine beschichtete Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um jedes Pellet vorsichtig in einem Milliliter eiskaltem Paraformaldehyd wieder aufzuhängen und 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius zu fixieren. Die Organoide auf halbem Weg zur Fixierungszeit vorsichtig wieder aufhängen.
Nach 45 Minuten 10 Milliliter eiskaltes PBS plus Tween 20 in jedes Rohr geben und vorsichtig durch Inversion mischen, bevor sie die Rohre 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius platzieren. Um die Organoide zu blockieren, am Ende der Inkubation, drehen Sie die Proben und setzen Sie die Pellets in mindestens 200 Mikroliter eiskalten organoiden Waschpuffer pro Brunnen zu plattieren. Dann übertragen Sie die Organoide auf einzelne Brunnen einer 24 Brunnen Hängeplatte für eine 15 Minuten Inkubation bei vier Grad Celsius.
Zum Immunlabeling 200 Mikroliter Organoid-Waschpuffer in einen leeren Referenzbrunnen geben und die Organoide an der Unterseite der Platte absetzen lassen. Wenn sich die Organoide abgesetzt haben, neigen Sie die Platte in einem 45-Grad-Winkel, um die Entfernung aller bis auf die letzten 200 Mikroliter Waschpuffer zu ermöglichen. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter Organoid-Waschpuffer, der die primären Antikörper von Interesse enthält, und legen Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln und Schütteln bei 40 Umdrehungen pro Minute.
Am nächsten Morgen, fügen Sie einen Milliliter Organoid Waschpuffer zu jedem Brunnen, und lassen Sie die Organoide auf den Boden der Platte für drei Minuten zu setzen. Wenn sich die Organoide niedergelassen haben, entfernen Sie alle bis auf die letzten 200 Mikroliter aus jedem Brunnen und waschen Sie die Organoide mit drei zweistündigen Wäschen mit einem Milliliter frischem organoiden Waschpuffer und leichtem Schaukeln und Schütteln pro Wäsche. Nach der dritten Wäsche, lassen Sie die Organoide an der Unterseite der Platte für drei Minuten absetzen, bevor Sie alle bis auf die letzten 200 Mikroliter Organoid-Waschpuffer aus jedem Brunnen entfernen.
Fügen Sie 200 Mikroliter Organoid-Waschpuffer mit den entsprechenden sekundären Antikörpern zu jedem Brunnen für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln und Schütteln hinzu. Am nächsten Morgen die Organoide mit drei zweistündigen Wäschen in einem Milliliter frischen Organoid-Waschpuffer pro Waschgang waschen, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche die Organoide in eine 1,5-Milliliter-Röhre pro Brunnen geben und die Organoide per Zentrifugation sammeln.
Für die optische Reinigung der Organoide, entfernen Sie so viel Waschpuffer wie möglich aus jedem Rohr, ohne die Organoide zu stören, und verwenden Sie eine modifizierte 200 Mikroliter Pipettenspitze, um mindestens 50 Mikroliter FUnGI zu jedem Pellet hinzuzufügen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur können die Organoide bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius oder bis zu sechs Monaten bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um Dias für die organoide Bildgebung durch konfokale Mikroskopie vorzubereiten, füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einem Silikondichtmittel und befestigen Sie eine modifizierte 200-Mikroliter-Pipettenspitze an der Spritze.
Verwenden Sie die Spritze, um ein Rechteck von einem mal zwei Zentimetern in der Mitte eines Dias zu zeichnen, und verwenden Sie eine zweite modifizierte 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um gelöschte Organoide in die Mitte des Rechtecks zu platzieren. Um einen Deckelschlupf über die Organoide zu legen, legen Sie zuerst die linke Seite der Abdeckung nach unten, bevor Sie langsam den Deckelrutsch von links nach rechts senken, bis keine eingeschlossene Luft vorhanden ist. Dann drücken Sie vorsichtig auf alle Kanten der Abdeckung rutschen, um es fest an der Silikonversiegelung zu befestigen.
Um die Organoide abzubilden, legen Sie das Dia auf die Bühne eines konfokalen Laserscanmikroskops und wählen Sie ein Multi-Tauch-25-X-Objektiv für die konfokale Bildgebung aus. Stellen Sie das Mikroskop auf die entsprechenden Erfassungseinstellungen ein, und wählen Sie eine geringe Laserleistung aus, um das Bleichen von Fotos zu reduzieren. Verwenden Sie den Z-Stack-Modus, um die oberen Obergrenzen des unteren Endes zu definieren, und legen Sie die Z-Schrittgröße auf optimal fest.
Wenn Sie große organoide Strukturen oder mehrere Organoide zusammen bildgeben, verwenden Sie den Kachelmodus mit einer 10%-Überlappung und zeigen den Interessenbereich an. Wenn alle Parameter festgelegt sind, erhalten Sie eine 3D-rendernde Darstellung der Bildgebung in der Bildverarbeitungssoftware, und optimieren Sie die Helligkeits-, Kontrast- und 3D-Renderingeigenschaften. Exportieren Sie dann RGB-Snapshots der Ergebnisse als TIFF-Dateien.
Die Stärke der 3D-Bildgebung im Vergleich zur 2D-Bildgebung wird durch diese Bilder von Maus-Mamma-Drüsenorganoiden veranschaulicht, die wie gezeigt erzeugt wurden. Die zentrale Schicht dieser repräsentativen Organoide besteht aus säulenförmigen K8/K18-positiven Leuchtkörperzellen, und die äußere Schicht enthält längliche K5-positive Basilikumzellen, die die Morphologie der Brustdrüse in vivo rekapitulieren. Diese polarisierte Organisation ist eine Herausforderung, von einem 2D-optischen Abschnitt des gleichen Organoids zu schätzen.
Ein weiteres Beispiel für eine komplexe Struktur, die ohne 3D-Informationen nicht zu interpretieren ist, ist das Netzwerk von MRP2-positiven Canaliculi, die die Sammlung der Gallenflüssigkeit menschlicher Leberorganoide erleichtern. Darüber hinaus ermöglicht die erhaltene Qualität und Auflösung eine halbautomatische Segmentierung und Bildanalyse. So können die Gesamtzahl der Zellzahlen und das Vorhandensein von Markern in bestimmten zellulären Subtypen in ganzen Organoiden quantifiziert werden.
Durch die Segmentierung der Kerne eines gesamten Organoids, das 140 Zellen enthält, können drei Zellen identifiziert werden, die eine hohe Positivität für den Ki67-Zellzyklusmarker aufweisen. Das optische Clearingmittel FUnGI übertrifft die ungeklärte und Fructose-Glyzerin-Clearing in fluoreszierender Signalqualität tief in einem Organoid. Mit FUnGI gelöschtEn Organoiden, die eine insgesamt erhöhte Fluoreszenzintensität im Vergleich zu ungeklärten Organoiden zeigen.
Beachten Sie, dass jedes übrig gebliebene BME in der Probe zu einer verminderten Antikörperdurchdringung und zu einem hohen Hintergrundsignal führen kann. Darüber hinaus sollten zystische Organoide nicht optisch gelöscht werden, wenn sie zusammenbrechen. Mit leichten Anpassungen an das Protokoll können die Proben mit Superauflösung konfokale, Multi-Photon- und Lichtbogenmikroskopie verwendet werden.
