Dieses Protokoll bietet ein wichtiges Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen intestinalen Immunzellen und dem Epithel zu untersuchen und zu analysieren, wie diese Wechselwirkungen bei der intestinalen Homöostase und Entzündung regulieren können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die exquisite Menge an experimenteller Kontrolle, die durch das Reduktions-in-vitro-Modell erleichtert wird, mit dem Fragen in der Epithel- und Immunbiologie beantwortet werden können. Dieses System wurde bereits verwendet, um die Rolle von ILC1 bei der Expansion von CD44-positiven Epithelkrypten zu bestimmen und hat das Potenzial, unser Verständnis von entzündungsvermittelten Magen-Darm-Erkrankungen weiter zu verbessern.
Platzieren Sie zunächst die thermisch vernetzende basale extrazelluläre Matrix auf Eis, um eine mit der Standardgewebekultur behandelte 24-Well-Platte aufzutauen und vorzuwärmen, indem Sie sie in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator legen. Entfernen Sie anschließend die Platte, die Organoide enthält, aus dem Inkubator und entsorgen Sie das Medium aus dem zu durchlassenden Brunnen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter eiskaltes fortschrittliches DMEM F12 zu den Bohrlöchern hinzu und ernten Sie mit einer P-1000-Spitze die Organoide aus allen Vertiefungen in ein 15-Milliliter-Rohr.
Spülen Sie den Boden der Bohrlöcher mit 250 bis 300 Mikrolitern eiskaltem DMEM F12 ab, um sicherzustellen, dass keine Organoide im Bohrloch verbleiben und sich in das 15-Milliliter-Rohr mit geernteten Organoiden einschließen. Suspendieren Sie das ein bis zwei Tage alte geerntete Organoidpellet in einem Milliliter eiskaltem DMEM F12. Beschichten Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit PBS2 pro angeborener lymphatischer Zellen, die die Probe replizieren, und verteilen Sie dann mit einer vorbeschichteten PBS2-Spitze etwa 100 bis 200 Organoide in die Röhre.
Mit einer PBS2-beschichteten P-1000-Spitze fügen Sie dem PBS2-beschichteten 1,5-Milliliter-Röhrchen, das die Organoide enthält, ein Volumen von nicht weniger als 500 ILC1, wie aus dem Sortierschritt berechnet, hinzu. Drehen Sie ILC1 und Organoide bei 300 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius nach unten und achten Sie darauf, Tischzentrifugen mit kleinem Durchmesser zu vermeiden, da sie die Zellen entlang der Kante des Rohrinneren ziehen, anstatt ein Pellet an der Spitze des Rohres zu erzeugen. Entfernen Sie dann den Überstand langsam und vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und legen Sie die Probe auf Eis.
Während Sie die Röhre auf einer kalten Oberfläche halten, resuspendieren Sie die Organoide und ILC in 30 Mikrolitern thermisch vernetzender basaler extrazellulärer Matrix mindestens 10 bis 15 Mal, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Tragen Sie 30 Mikroliter ILC-Organoide pro Vertiefung in der thermisch-vernetzenden basalen extrazellulären Matrix auf eine vorerwärmte 24- oder 48-Well-Platte auf, um eine einzige Kuppel zu bilden. Danach legen Sie die Platte für 10 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid direkt in den Inkubator.
Dann fügen Sie 550 Mikroliter vollständiges ILC1-Medium pro Bohrung mit den gewünschten experimentellen Zytokinen oder blockierenden Antikörpern hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Entfernen Sie die Platte nach 24 Stunden vorsichtig aus dem Inkubator und lassen Sie die Platte eine Minute lang in einer Gewebekulturhaube sitzen, um sicherzustellen, dass sich die Lymphozyten absetzen. Entfernen Sie 200 bis 250 Mikroliter Medien und legen Sie sie in eine leere Vertiefung einer 24-Well-Platte.
Überprüfen Sie mit einem inversen Mikroskop den Überstand, um sicherzustellen, dass keine Lymphozyten entfernt wurden. Wenn der Überstand klar ist, fügen Sie 300 Mikroliter frisches ILC1-Medium zur Co-Kultur im ursprünglichen Brunnen hinzu. Wenn Lymphozyten im Überstand vorhanden sind, zentrifugieren Sie bei 300 bis 400 G für drei bis fünf Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikroliter frischem ILC1-Medium.
Fügen Sie dann die Zellsuspension zu den verbleibenden 200 bis 250 Mikrolitern Medien im ursprünglichen Vertiefungsraum hinzu. Führen Sie nachgelagerte Analysen mittels Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie oder FACS-Aufreinigung von Zielpopulationen in Lysepuffer für die Genexpressionsanalyse durch eine Einzelzell- oder Massen-RNA-Suche oder RT-qPCR durch, wie im Text beschrieben. Nach erfolgreichem Abschluss der Passage zeigten gesunde und robuste Organoidkulturen, dass die frisch isolierten Krypten innerhalb von zwei bis vier Tagen knospende Kryptenstrukturen bilden sollten.
Die durchflusszytometrische Analyse wurde durchgeführt, um Dünndarm-ILC1 aus der transgenen RON-Gamma-T-Murin-Reporterlinie zu isolieren, und der erwartete ILC-Zählbereich betrug 350 bis 3.500 isolierte Zellen. Nach der Aussaat mit Organoiden können Co-Kulturen durch immunchemische Zytochemie sichtbar gemacht werden. Die konfokale Mikroskopie zeigte die Bilder von Dünndarmorganoiden, die allein und in Gegenwart von ILC1s kultiviert werden.
Die immunzytochemische Färbung zeigt das Vorhandensein von CD45-positivem ILC1 in unmittelbarer Nähe zu Zonula-Okkludenprotein-1-positiven Epithelzellen in organoiden ILC1-Co-Kulturen. Die Durchflusszytometrie zeigte, dass das epitheliale zelluläre Adhäsionsmolekül intestinale Epithelzellen in Organoiden markiert, während CD45 ILC1s markiert. Das durchflusszytometrische Diagramm und die Immunchemie zeigten eine erhöhte Expression von CD44 in Darmepithelzellen, wenn es mit ILC1 kokultiviert wurde.
Die RT-qPCR-Studien zeigen, dass die ILC1-Kokultur spezifisch CD44-Variante 6 hochregulierte, die durch TGF-beta 1, 2, 3 neutralisierende Antikörper gehemmt und durch rekombinantes TGF-beta 1 in Dünndarm-Organoid-Nur-Kulturen hochreguliert wurde. Es ist wichtig, bei der Manipulation der Organoide vorsichtig zu sein, um sicherzustellen, dass die gesamten Strukturen erhalten bleiben und zu überprüfen, ob die Strukturen nach der Zentrifugation ausreichend pelletiert wurden. Durch die Erhöhung der Systemkomplexität durch die Zugabe anderer Immun- und Nicht-Immunkomponenten kann dieses In-vitro-System genutzt werden, um weitere Fragen in der Darmbiologie zu beantworten.
