Bereiten Sie zunächst zwei Milliliter 4%Formalin oder ein anderes geeignetes Fixiermittel vor. Halten Sie auch eine Petrischale, eine Pinzette und eine chirurgische Schere bereit, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen. Legen Sie den ordnungsgemäß eingeschläferten kryoverletzten Fisch in eine Petrischale mit deionisiertem Wasser.
Führen Sie mit einer Schere einen Schnitt durch den Körper durch, vor und hinter dem Schwanzstiel. Lassen Sie das Gewebe im deionisierten Wasser in der Petrischale ausbluten. Sammeln Sie den Schwanzstiel mit einer Pinzette und übertragen Sie ihn in die vorbereitete Fixierlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
Drehen Sie das Rohr mehrmals vorsichtig um. Waschen Sie das fixierte Taschentuch vor der Montage 10 Minuten lang in PBS auf einer Wippe. Dann wird es in ein auf vier Grad Celsius vorgekühltes Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Lösung von 30%iger Saccharose in deionisiertem Wasser überführt und mehrmals vorsichtig umgedreht.
Lassen Sie die Röhre mindestens 24 Stunden bei 4 Grad Celsius aufrecht stehen. Füllen Sie eine Einbettform mit einer fünf Millimeter dicken Schicht OCT-Einbettmedium. Setzen Sie den Schwanzstiel mit einer Pinzette auf den Boden der Form.
Passen Sie die Ausrichtung für transversale oder koronale Abschnitte an. Lassen Sie das Medium in einer Schachtel Trockeneis gefrieren. Sobald das Gewebe in der gewünschten Position stabilisiert ist, füllen Sie den Rest der Form auf, bevor das OCT vollständig zufriert.
Lagern Sie die Form mindestens eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius, bevor Sie das Gewebe mit einem Kryostaten durchtrennen. Das Ausmaß der Kryoverletzung an verschiedenen Tagen nach der Kryoverletzung (DPCI) wurde in den kaudalen Stielschnitten mit Hilfe einer Trichromfärbung aus Anilinblau, Säurefuschin und Orange-G analysiert. Die beschädigten Stellen wurden durch das Fehlen einer orangefarbenen Färbung bestimmt.
Bei 4 und 7 dpci zeigte der Querschnitt eine stark degenerierte Skelettmuskulatur in der kryoverletzten Körperflanke. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass die verletzte Seite des kaudalen Stiels bei 4 DPCI reichlich DAPI-positive Zellen, aber wenig bis gar kein F-Aktin und Tropomyosin 1 enthielt, was auf degenerierte Muskeln hindeutet. Bei 7 dpci konnten Tropomyosin 1 und F-Aktin in der Wunde nahe der vertikalen Körpermittellinie nachgewiesen werden, was auf den Beginn der Neubildung von Myofasern hinweist.
Bei 30 dpci zeigten beide Körperseiten eine ähnliche Verteilung der F-Aktin-Färbung, was auf eine effiziente Wiederherstellung der Skelettmuskulatur hindeutet.
