Die in vivo elektrische Kardiographie ist das einzige diagnostische Werkzeug für die elektrische Phänotypisierung bei lebenden Zebrafischen in Querschnitts- und Längsstudien. Unser Ansatz ist praktisch, minimal invasiv und kostengünstig, da wir ein Datenerfassungssystem für Säugetiere umfunktionieren. Wir legen Wert auf die Strategie der Echtzeit-EKG-Interpretation zur frühzeitigen Validierung der Datenqualität.
Da die EKGs von Mensch und Zebrafisch ähnlich sind, erleichtert die In-vivo-Elektrokardiographie die Verwendung von Zebrafischen bei der Modellierung der menschlichen Herzphysiologie sowie das Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz auf Kardiotoxizitäten wie QT-Verlängerung. Eine korrekte Lead-Positionierung ist der Schlüssel zum Erfolg. Da die normale Zebrafisch-T-Welle die kleinste ist, priorisieren Sie die Optimierung ihrer Amplitude gegenüber der größeren P- und R-Welle.
Studieren Sie normale und pathologische EKG-Muster, um Ihre EKG-Ergebnisse selbst zu interpretieren. Verlassen Sie sich nicht nur auf die automatische Interpretation der EKG-Analysesoftware. Transportieren Sie am Tag des Experiments den Zebrafisch aus dem Aquarium ins Labor.
Um das In-vivo-EKG-Aufzeichnungssystem einzurichten, verbinden Sie die wesentlichen Geräte und legen Sie die drei farbcodierten Edelstahlelektroden des EKG-Leads in die drei farblich abgestimmten Zugangsportale des Verstärkers ein. Zur Induktion der Anästhesie stufe 4 einen erwachsenen Zebrafisch in eine Schale eintauchen, die eine Lösung von Anästhetika in den niedrigsten vorbestimmten Konzentrationen enthält, die vom institutionellen Tierpflege- und Gebrauchsausschuss genehmigt wurden. Sobald der Zebrafisch die Anästhesie der Stufe 4 für drei Sekunden aufrechterhalten hat, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zangen, um den Fisch sofort auf einen feuchten Schwamm mit einem Schlitz, einer ventralen Oberfläche nach oben, für die Platzierung der drei EKG-Elektroden zu übertragen.
Setzen Sie die positive Elektrode vorsichtig in die ventrale Mittellinie auf Höhe des Bulbus arteriosus ein bis zwei Millimeter über einer imaginären Linie ein, die die beiden unteren Ränder der Operculums verbindet. Positionieren Sie die negative Elektrode kauarisch und 0,5 bis einen Millimeter seitlich links zur positiven Elektrode in einem Abstand größer als die maximale apicobasale Länge des erwachsenen Zebrafischventrikels, und positionieren Sie dann die Referenzelektrode kauarisch in der Nähe des Analbereichs. Starten Sie das System für die EKG-Aufzeichnung und öffnen Sie das EKG-Datenerfassungsprogramm.
Wählen Sie eine gewünschte Einstellung aus den Dropdown-Menüs für Reichweite, Tiefpass und Hochpass aus. Drücken Sie Start, um eine kontinuierliche lückenlose EKG-Aufnahme mit einer Abtastrate von einem Kilohertz zu initiieren. Um die Lead-Positionierung für ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, drücken Sie Stop, um die Aufnahme zu stoppen und die Spur kurz nach dem allerersten Aufnahmeversuch für jedes Herz zu überprüfen.
Wenn erwartet wird, dass das EKG normal ist, bestätigen Sie, dass alle EKG-Wellenformen unterschiedlich und gut sichtbar sind und dass die P-Welle, der Netto-QRS-Komplex und die T-Welle alle positiv sind. Der wichtigste Schritt ist die Lead-Positionierung, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Wenden Sie unsere vier Validierungskriterien nach dem allerersten EKG-Aufnahmeversuch für jeden Fisch an, um korrekturkorrektes Feedback zu erhalten.
Wenn ein normales EKG erwartet wird, positionieren Sie die Elektroden nach Bedarf neu, bis alle diese vier Validierungskriterien erfüllt sind. Wenn eine normale T-Welle erwartet wird, aber die T-Welle zu klein ist, positionieren Sie die Elektroden neu, um die Amplitude der T-Welle zu maximieren. Setzen Sie die EKG-Aufnahme nach der Optimierung der Bleipositionierung fort und speichern Sie die EKG-Sweeps für die nachfolgende Analyse.
Entfernen Sie am Ende der EKG-Aufnahmesitzung die Elektroden vorsichtig, ohne den Fisch zu verletzen. In Überlebensstudien übertragen Sie die Fische in frisches, sauerstoffreiches Fischwasser ohne Tricain. Bitte beachten Sie, dass in diesem Video die Lese- und Gehaltsversorgung der Fische aus der Anästhesie eingestellt wird, um den Lesern die Rückgewinnung von der Anästhesie zu erleichtern.
Um die Erholung von der Anästhesie in Überlebensstudien zu erleichtern, verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um kräftig Wasser über die Kiemen zu spritzen, bis die Fische wieder regelmäßige Kiemenbewegung oder Schwimmen wieder aufnehmen, dann überwachen Sie die Fische für die vollständige Erholung von der Anästhesie, bevor Sie die Fische indas Aquarium zurück. Der Fisch gilt als vollständig aus der Anästhesie genesen, wenn er mindestens fünf Sekunden aufrecht schwimmen kann. Um die Analyseeinstellungen zu definieren, öffnen Sie das EKG-Datenanalyseprogramm und öffnen Sie die interessierte EKG-Datei, um die vollständige EKG-Ablaufverfolgung anzuzeigen.
Verwenden Sie die Maus, um einen Abschnitt von Interesse in der EKG-Ablaufverfolgung zu analysieren. Wählen Sie im Menü EKG-Analyse EKG-Einstellungen aus, um ein Dialogfeld zu öffnen, um verschiedene Parametereinstellungen für die automatische Softwareanalyse vorzudefinieren. Analysieren Sie den Herzrhythmus und die Rate und bestimmen Sie, ob der Herzrhythmus Sinus ist oder nicht, regelmäßig oder unregelmäßig.
Um die Herzfrequenz zu bestimmen, stellen Sie sicher, dass die Software alle P- und R-Wellen korrekt identifiziert, da die Atrial- und Ventrikulenrate auf dem PP- bzw. RR-Intervall basiert. Korrigieren Sie alle Fehler bei der automatischen Identifizierung, indem Sie die falsch platzierten Cursor auf die entsprechenden P- und R-Wellen bewegen. Um Intervalle und Wellendauern zu berechnen, öffnen Sie die EKG-Analyse und die Mittelungsansicht, um mehrere aufeinander folgende Herzzyklen zu einem einzigen durchschnittlichen Signal zu verketten.
Stellen Sie sicher, dass die Software den Anfang und das Ende der P-Welle, den QRS-Komplex und die T-Welle korrekt identifiziert, und bewegen Sie dann die falsch platzierten Cursor an die entsprechenden Positionen, um Fehler bei der automatischen Identifizierung zu korrigieren. Um die EKG-Messungen zu exportieren, wählen Sie Tabellenansicht aus, um alle EKG-Messungen zu überprüfen und die von Interesse interessierten Messungen für die nachfolgende Analyse in eine Kalkulationstabelle zu kopieren und einzufügen. Um eine EKG-Spur zu exportieren, verwenden Sie die Lupe, um einen Abschnitt hervorzuheben, der für den EKG-Sweep von Interesse ist, und kopieren Und fügen Sie den Sweep in das gewünschte Dokument ein.
Im Zusammenspiel mit dem menschlichen Herz, das zwei Vorhöfe und zwei Ventrikel hat, hat das Zebrafischherz nur ein Atrium und einen Ventrikel. Trotz seiner scheinbaren anatomischen Einfachheit teilt das Zebrafischherz mehrere EKG-Funktionen mit dem menschlichen Herzen. Die richtige Bleiplatzierung erfordert die Ausrichtung des Leads an der vermuteten Herzhauptachse.
Wenn die Elektroden zu oberflächlich in die Dermis eingesetzt werden, gilt die Leitung als indirekt und die Spannungssignale sind klein. Wenn die Elektroden in die entsprechende Ein-Millimeter-Tiefe in die Pectoralis-Muskulatur eingesetzt werden, wird die Leitung halbdirekt und die Spannungssignale erhöhen sich. Werden die Elektroden jedoch tiefer als einen Millimeter in den Ventrikel eingesetzt, wird die Leitung direkt und die Spannungssignale steigen noch weiter an, wobei sich die R-Wellenamplitude im Vergleich zu dem Zeitpunkt, zu dem die Elektroden in der entsprechenden Tiefe eingesetzt werden, um das Vierfache erhöht.
Die EKG-Spur von zu tief eingelegten Elektroden zeigt auch neue Anzeichen einer Verletzung des ventrikulären Myokards, wie eine neue ST-Depression und eine neue T-Welleninversion. Wenn die positiven und negativen Elektroden in ihrer Platzierung geschaltet werden, werden ungewöhnliche Inversionen aller EKG-Wellenformen beobachtet. Eine unangemessene Sedationstiefe kann auch die Qualität der In-vivo-EKG-Aufnahme beeinträchtigen.
Denken Sie daran, tief genug zu beästhetieren, um die Fische zu immobilisieren, ohne sie zu töten. Positionieren Sie die Elektroden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren und eine übermäßige Abhängigkeit von der automatischen Softwareanalyse zu vermeiden. Nach diesem minimalinvasiven Überlebensverfahren ist es möglich, andere Verfahren wie partielle Ablation, Resektion des Herzens oder serielle EKG-Untersuchungen in Arzneimittelreaktionen oder Längsschnittstudien durchzuführen.
Systemische Toxizitäten sind mögliche Komplikationen eines Anästhetikums, einschließlich Tricain. Diese Toxizitäten können reduziert werden, indem die Synergie mehrerer Anästhetika in Diem ausgegnet wird, um die Dosis einzelner Wirkstoffe zu senken.
