Um mit der Isolierung und Normalisierung von DNA-haltigen, vernetzten Proteinen zu beginnen, wird das Medium nach der Ubiquitylierung und der medikamentösen Behandlung mit SUMOylierung mit einer Saugpipette abgesaugt. Spülen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS, bevor Sie 600 Mikroliter DNAzol-Reagenz hinzufügen. Rühren Sie die Platte langsam 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einer vibrierenden Plattform und geben Sie 0,3 Milliliter 100% kaltes Ethanol direkt auf die Platte.
Wiederholen Sie das Rühren, bis ein undurchsichtiges Nukleinsäureaggregat sichtbar wird. Als nächstes wird das Zelllysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 20.000 G zentrifugiert.Nach dem Absaugen des Überstandes wird die Nukleinsäure und das vernetzte Proteinpellet in einem Milliliter 75%igem Ethanol gewaschen, gefolgt von einer zweiminütigen Zentrifugation bei 20.000 g und vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand an, bevor Sie ihn mit der gleichen Geschwindigkeit nach unten schleudern und die restliche Flüssigkeit mit einer P-20-Pipette entfernen.
Lassen Sie das Pellet fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Lösen Sie das getrocknete Nukleinsäure-Pellet in 0,1 Milliliter doppelt destilliertem Wasser auf, indem Sie es einige Male auf und ab pipettieren. Anschließend wird die Suspension bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad 30 Minuten lang inkubiert, bis das Pellet mindestens dreimal aufquillt.
Beschallen Sie die Proben 10 Sekunden lang mit einer Ultraschall-Prozessorsonde mit einer Amplitude von 30 % und quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Vis-Spektrometer. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um die Konzentration der DNA auf 400 bis 500 Nanogramm pro Mikroliter in 120 Mikrolitern einzustellen. Dann werden 20 Mikroliter der Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen als Kontrolle der unverdauten DNA-Beladung überführt.
Fügen Sie 2.000 Geleinheiten Mikrokokken-Nuklease und 11 Mikroliter 10X-Kalzium-Mikrokokken-Nuklease-Reaktionspuffer zur DNA hinzu, die in den verbleibenden 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser gelöst ist. Bei 37 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren.
