Die Autoren danken Céline Jeanty für ihre Unterstützung bei der Herstellung von Zellpellets mit DerBehandlung von MG-132, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben, und Elise Mommaerts für ihre Bereitstellung von E. coli Pellets, die im Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung eines schweren Peptidstandards
<ol><li>Je nach Lieferant und Qualität der gekauften schweren Peptide müssen die schweren Peptide verdünnt werden. Dieses Protokoll verwendete die in Tabelle 1berichteten Peptidsequenzen, wobei die C-terminale Aminosäure zu Lysin (13C615N2-lysin) oder Arginin (13C615N4-arginin) modifiziert wurde.<ol>
<li>Mischen Sie die schweren Peptide, verdünnen Sie die Mischung mit 50% Acetonitril (ACN), um eine Peptidmischung mit jedem Peptid bei 10 M zu erstellen.</li>
		<li>Aliquots des Peptid-Mixes erstellen und bei -80 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Beispiellyse HINWEIS: Die Stabilität von Ubiquitinketten muss bei der Probenvorbereitung berücksichtigt werden. Biologische Proben und Puffer bei 4 °C gekühlt aufbewahren und Proben so schnell wie möglich in den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer aufnehmen.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 1 M NH4HCO3 (Ammoniumbicarbonat) in Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8 ein.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung von 200 mM N-Ethylmaleimid (NEM) in Wasser vor.</li>
		<li>Bereiten Sie den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer mit 8 M Harnstoff in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM vor. Ubiquitin-Stabilisierungspuffer muss jedes Mal frisch zubereitet werden. HINWEIS: Eine 5 ml Lösung von 8 M Harnstoff benötigt bei der Ausdehnung des Wassers in einer gesättigten Lösung mit Harnstoff deutlich weniger als 5 ml Wasser. VORSICHT: Bereiten Sie den Puffer nicht über 50 °C vor, da Harnstoff bei hohen Temperaturen zu Polyurea neigt.</li>
		<li>Setzen Sie die biologische Probe, die im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer untersucht werden soll, mit dem Ziel von 0,5 g/l Protein, und limieren Sie die Zellen mit einer geeigneten Methode für die Probe. Für die Zelllinien in diesem Protokoll wurde eine Beschallungsmethode mit drei 10 s Impulsen mit einem SFX 150 Branson Sonifier mit 70% Intensität und 10 s Brüchen auf Eis zwischen jedem Puls verwendet.</li>
		<li>Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.</li>
		<li>Überstand auf ein frisches, proteinarmes Mikrozentrifugenrohr übertragen. Proben können bei Bedarf bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Proben und Kontrollen
	<ol>
<li>Wenn die Proben eingefroren sind, mischen Sie (z.B. mit einem Thermomixer), während sie aufgetaut werden, um den Harnstoff schnell aufzulösen. VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.</li>
		<li>Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.</li>
		<li>Übertragen Sie 20 g Probe in ein frisches, bindendes Mikrozentrifugenrohr und stellen Sie das Volumen mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer auf 50 l ein.</li>
		<li>Erstellen Sie einen negativen Kontrollwert mit einem normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l). In dieser Probe sollte keine leichte Version jedes Peptids vorhanden sein, so dass eine leichte Kontamination durch die spike-in schweren Peptide beobachtet werden kann. Diese negative Kontrolle wurde auch für die Aufbewahrungszeitplanung des in Abschnitt 3.1 beschriebenen PRM verwendet.</li>
		<li>Eine positive Steuerung wurde auch mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und der Zugabe kommerziell erhältlicher Kettentypen zum normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l) geschaffen. Häufig sind K63, K48 und M1 verfügbar. In den repräsentativen Ergebnissen wurden 20 ng von K48, K63 und M1 verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Reduktion, Alkylierung und Verdauung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 50 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) in Wasser vor und stellen Sie die Probe mit 1 M NaOH auf pH = 8 ein.</li>
		<li>Eine Kultur von E. coli, die in LB-Brühe angebaut wurde, wurde 5.000 x g für 5 min zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden, das dann 2x mit PBS gewaschen wurde, bevor es im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer bei 5 g/l wieder aufsuspension wurde.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Probe und Kontrolle 1 g E. coli Lysat hinzu. Dieses Protokoll verwendet E. coli (DH10B), aber jedes komplexe Lysat ohne Ubiquitin kann verwendet werden. Beachten Sie, dass Ubiquitin allen Eukaryoten gemeinsam ist. HINWEIS: Die Verwendung einer E. coli Lysat-Matrix reduziert den Verlust von Peptiden aufgrund der unspezifischen Haftung an Kunststoffen. Dies ist besonders auffällig bei der Negativkontrolle oder bei Proben mit begrenztem Proteingehalt und hat einen starken Einfluss auf die Beobachtung von K6312.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung aus 500 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) in MS-Wasser (DTT kann als Alternative verwendet werden).</li>
		<li>Reduzieren Sie die Proben und Kontrollen durch Zugabe von TCEP auf eine Endkonzentration von 50 mM. Wirbel kurz vor der Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Bei Verwendung von DTT muss die Temperatur auf 50 °C erhöht werden. VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung von 550 mM Chloroacetamide (CAA) in NH4HCO3vor. Im Dunkeln lagern.</li>
		<li>Alkyliern Sie die Proben und Kontrollen, indem Sie CAA zu einer Endkonzentration von 55 mM hinzufügen. Wirbel kurz vor der Inkubation für 20 min bei RT im Dunkeln. HINWEIS: CAA wird anstelle von Iodoacetamid als Reduktionsmittel verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer doppelten Carbamidmethylmodifikation (114.0429) an einem Lysinrückstand zu verringern, der mit einer -GG-Modifikation verwechselt wird (114.0429)13.</li>
		<li>Fügen Sie endopeptidase LysC zu den Proben bei 1:25 (w/w) Verhältnis zum Proteingehalt hinzu. 3 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Proben und Kontrollen mit 200 l von 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Fügen Sie Trypsin den Proben im Verhältnis 1:25 w/w zum Proteingehalt hinzu. 12 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10% Ameisensäure (FA) Lösung in MS-Grade-Wasser in einem Verhältnis von 1:10 v/v zu jeder Probe und Kontrollprobe hinzu. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert <3) vor der C18-Bereinigung ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Ameisensäure hinzu.</li>
		<li>Zu jeder Probe und Kontrolle fügen Sie 0,5 l des schweren Peptidstandards hinzu, der in Abschnitt 1 erstellt wurde.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptid-Reinigung
	<ol>
<li>Mehrere Hersteller bieten C18 Reinigungsspitzen oder Platten an. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das verwendete Produkt und trockene eluierte Peptide in einer Vakuumzentrifuge, die für die MS-Analyse bereit ist.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse durch LC-MS/MS
<ol><li>Führen Sie eine erste PRM-Analyse auf den schweren Peptidstandard in einer ungeplanten Weise durch.<ol>
<li>Setzen Sie die getrockneten Proben in 10 l MS-Ladepuffer 2% ACN/0,05% Trifluoressigsäure (TFA) wieder auf.</li>
		<li>Rüsten Sie einen HPLC mit einer Analysesäule der Kehrphase C18 (75 x 15 cm, 2 m 100 c18 Perlen) für Nanofluss MS aus. Bilden Sie lineare Gradienten, die MS-Wasser austauschen, ergänzt mit 0,1% FA mit ACN mit 0,1% FA. Hier wurde eine Opferfalle-Säule (75 x 2 cm, 3 m, 100 c18 Perlen) verwendet, um die Lebensdauer der analytischen Säule zu erhalten, ist aber nicht erforderlich.</li>
		<li>Koppeln Sie die Ausgabe der analytischen Säule mit einer Nano-ESI-Quelle auf einem hochauflösenden Massenspektrometer.</li>
		<li>Verwenden Sie eine geeignete gezielte Proteomik-Methode für das Massenspektrometer. Beispiel: Bei einer Q-Exactive plus einer Zwei-Experiment-Methode zwischen einem Full MS und einem PRM-Experiment. Für das Full MS-Experiment wurde eine Auflösung von 120.000 mit einem AGC-Ziel von 1e6 und 240 ms als Maximale IT verwendet. Für das PRM-Experiment wurde das gleiche AGC-Ziel und die maximale IT mit einer niedrigeren Auflösung von 60.000 und einem Isolationsfenster von 1,2 m/z verwendet.</li>
		<li>Mit dem HPLC-Autosampler 200 ng der Negativkontrolle in die analytische Säule injizieren. Wenden Sie einen linearen Gradienten auf die Probe auf die analytische Spalte an, wodurch die ACN-Konzentration über einen Zeitraum von 45 min von 2–25 % erhöht wird. HINWEIS: Die 25% ACN-Konzentration ist niedriger als üblich für Proteomik aufgrund der geringen hydrophilen Natur der typischen Ubiquitin-Topologie-charakteristischen Peptide. Wenn andere Peptide quantifiziert werden sollen, kann eine höhere ACN-Konzentration gewünscht werden, um eine gute Zieltrennung zu erreichen.</li>
		<li>Analysieren Sie die Ergebnisse des Planungslaufs wie in Abschnitt 4.2 beschrieben, um eine Liste mit geplanter Einschlussaufnahme zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse der Proben<ol>
<li>Führen Sie die verbleibenden Beispiele, wie für die Planung in 3.1 beschrieben, aus, abgesehen von der Verwendung der in Abschnitt 4.2 erstellten Liste für geplante Einschlusse. HINWEIS: Nach dem Positivsteuerelement muss ein Leerzeichen ausgeführt werden, um sicherzustellen, dass in nachfolgenden Stichproben keine Übertragung vom vorherigen Lauf erkannt wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Softwareanalyse
<ol><li>Erstellen Sie eine Einschlussliste mit geeigneten Formatierungen für die verwendete MS. Dieses Protokoll verwendet die Open-Source-Software Skyline (Version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), die gut dokumentierte Unterstützung und Hilfe bietet. Mithilfe der Exportisolationslistenfunktion kann eine Einschlussliste für mehrere Massenspektrometer erstellt werden.<ol>
<li>Öffnen Sie ein neues Skyline-Dokument.</li>
		<li>Wählen Sie schwere Isotopenmodifikationen entsprechend schweren Topologie-charakteristischen Peptiden aus. In den Einstellungen| Peptideinstellungen unter der Registerkarte Änderung, klicken Sie auf das Namensfeld, um die mögliche Änderung zu sehen. Die Auswahl basiert auf dem Isotopenzustand der gekauften schweren Peptide. In diesem Beispiel wurden synthetische Peptide verwendet, die entweder ein schweres Lysin (13C615N2-lysin) oder ein schweres Arginin (13C615N4-arginin) am C-Terminus trugen. Geeignete Bezeichnungen wären: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" und "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Wählen Sie Einstellungen aus| Übergang. Unter der Registerkarte Filter enthalten Precursor Charges 2, 3, 4.</li>
		<li>Peptide einfügen, indem Sie Bearbeiten auswählen| Einfügen| Peptide.</li>
		<li>Füllen Sie die relevanten Felder einschließlich der topologie-charakteristischen Peptidsequenz und eines Proteinnamens (z. B. "Chain–K63") aus.</li>
		<li>Erweitern Sie jedes Peptid, das jetzt im Bedienfeld "Ziele" angezeigt wird. Löschen Sie unerwünschte Ladezustände. Der bevorzugte Ladezustand und die Kollisionsenergie, die je nach verwendetem Massenspektrometer unterschiedlich sein können, ist für jedes topologiecharakteristische Peptid in Tabelle 1dargestellt.</li>
		<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Sequenz und wählen Sie Ändern. Fügen Sie ein GG als strukturelle Änderung hinzu, indem Sie auf das Namensfeld klicken und <Alle anzeigenauswählen ... > bevor Sie "GlyGly (K)" auswählen.</li>
		<li>Exportieren Sie die Isolationsliste Datei| Export| Isolationsliste, wählen Sie den Instrumententyp aus, und legen Sie den Methodentyp auf Standardfest. Wenn Sie OK auswählen, wird eine Eingabeaufforderung zum Speichern einer *.csv Datei geöffnet, die zum Erstellen einer PRM-Methode verwendet werden kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellen Sie eine geplante Inklusionsliste basierend auf einem schweren Peptid-Scheduling-Lauf, der hier mit der Open-Source-Skyline-Software erläutert wird.<ol>
<li>Erstellen Sie eine Zielliste, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.</li>
		<li>Importieren Sie den Planungslauf in 3.1, indem Sie Datei auswählen| Import| Ergebnisse.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Kennungen. Das schwere Signal für jedes Peptid ist beobachtbar, indem man auf die Masse für jeden schweren Peptideintrag klickt. Die korrekte Erkennung der Spitze wird oft automatisch bestimmt, aber die Software kann eine manuelle Kuration erfordern, indem Sie die Spitze per Klick und Ziehen unter der x-Achse auswählen.</li>
		<li>Retentionszeiten, die für die schweren Varianten ausgewählt wurden, werden auch auf die Lichtversionen angewendet, wodurch ein Zeitplan für das PRM erstellt wird. Das Planungsfenster kann unter Einstellungen geändert werden| Peptideinstellungen mithilfe der Registerkarte Vorhersage, indem Sie das Zeitfensterändern.</li>
		<li>Eine geplante Einschlussliste kann nun mit File exportiert werden| Export| Isolationsliste und Auswahl des entsprechenden Instrumententyps und Einstellungsmethodentyps auf Geplant.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie die Daten.<ol>
<li>Importieren Sie die Stichproben auf die gleiche Weise wie für die Planungslaufanalyse in Abschnitt 4.2.</li>
		<li>Nach dem vollständigen Import aller Proben wird die Kuration der Übergänge empfohlen. Dies ist der Prozess, durch den Übergänge mit Interferenzen oder schlechten Signal-Rausch-Verhältnissen entfernt werden. Ein Beispiel für ein Chromatogramm vor und nach der Kuration ist in Abbildung 4dargestellt.</li>
		<li>Die Daten können nun entweder exportiert werden, indem Sie mit der rechten Maustaste auf relevante Diagramme klicken und Daten kopieren auswählen oder indem Sie Datei auswählen| Export| Ergebnisse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Die Analyse des Ubiquitinzustandes innerhalb eines Proteoms gewinnt für eine Vielzahl biologischer Fragen zunehmend an Bedeutung. Die Beschreibung des Ubiquitinationszustands einer Probe muss sich nicht nur auf das Profil der ubiquitinierten Proteine konzentrieren, sondern auch auf die Topologie einer solchen Ubiquitination. Die Bewertung dieser Topologie durch gezielte MS, wie hier beschrieben, spielt eine Rolle in einer Vielzahl biologischer Untersuchungen.
Es sollte verstanden werden, dass...

Die enge Regulierung der Proteinfunktion und -stabilität ist von größter Bedeutung, da sie wichtige Treiber der phätotypischen Kontrolle der Biologie sind. Die Funktion eines Proteins besteht aus zwei Komponenten: seiner intrinsischen Polypeptidsequenz und allen posttranslationalen Modifikationen (PTMs). Verschiedene chemische PTMs wurden identifiziert, einschließlich Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung1. 1975 identifizierten Goldstein et al.2 ein kleines Protein und nannten es aufgrund seiner allgegenwärtigen Natur Ubiquitin. Ubiquitin erwies sich als wichtig für den Proteinabbau3. Seitdem steht jedoch fest, dass die Funktion von Ubiquitin als Signalmolekül weit über die Regulierung der Proteinstabilität hinausgeht. Ubiquitin Signalisierung ist in einer Vielzahl von anderen biologischen Funktionen beteiligt, wie Proteinstabilisierung, Autophagie, Zellzykluskontrolle, und Proteinhandel4.
Während andere PTMs im Allgemeinen binär sind (d. h., das Protein wird modifiziert oder unverändert gelassen) für eine bestimmte Stelle, kann Ubiquitin ein Protein sowohl als Monomer oder als polymere Kette modifizieren, wobei das angefügte Ubiquitin selbst ubiquitiniert ist. Darüber hinaus kann sich diese Polyubiquitinationskette in mehreren Topologien mit der Ubiquitination des vorherigen Ubiquitins entwickeln, das an einer von acht Verknüpfungsstellen5,6anhängt. Ubiquitin wird durch einen mehrstufigen enzymatischen Prozess übertragen (Abbildung 1), bei dem der C-Terminus von Ubiquitin mit einem seiner sieben Lysinrückstände (K06, K11, K27, K29, K33, K48 oder K63) oder dem N-Terminal des vorherigen Ubiquitins (als M1 oder lineare Ubiquitination bezeichnet)5,6verbunden ist. Diese Kettentopologie ist der Schlüssel zum Schicksal des Proteins, das verändert wird. Beispielsweise führt die Modifikation mit einer K48 oder K11-Verbindungskette zum Abbau des modifizierten Proteins am Proteasom, während eine lineare Kette für die Aktivierung der NF-kB-Signalisierung notwendig ist. Daher ist die relative Verteilung dieser Kettentopologien für eine Vielzahl biologischer Fragen relevant.
Die Verwendung der Massenspektrometrie (MS) ist von besonderem Nutzen für die Analyse der Ubiquitin-Kettentopologie, da sie nicht auf antikörperbasierte oder affinitätsbasierte Wechselwirkungen7,8angewiesen ist, von denen viele eine begrenzte Spezifität aufweisen und nicht zwischen den verschiedenen Kettentypen unterscheiden. Eine andere Nachweismöglichkeit besteht darin, genetisch veränderte Ubiquitin-Mutationen zu verwenden. Hier wird ein bestimmtes Lysin gegen Arginin ausgetauscht, das die Modifikation durch Ubiquitin nicht unterstützen kann. Der Mangel an Ubiquitin-Kettenbildung auf dem Substratprotein wird dann als Beweis für eine spezifische Topologieinterpretiert 9.
Die MS-basierte Identifizierung ubiquitinierter Proteine basiert auf der Tatsache, dass der C-Terminus von Ubiquitin einen Argininrückstand in Position 74 enthält, der von Trypsin während der proteolytischen Vorbereitung der Proben für die MS-Analyse erkannt wird und das C-terminale Doppelglycin trennt. Dieses GlyGly (-GG) bleibt an der ε-Amino-Gruppe des Lysinrückstands des Substratproteins befestigt. Für die Ubiquitin-Topologie-Analyse erfolgt die Modifikation an einem der sieben Lysinrückstände von Ubiquitin. Dadurch wird ein Satz von sieben Schlüsselpeptiden erstellt, die einen Lysinrückstand tragen, der durch GG modifiziert wird, spezifisch für jede der Topologien (Abbildung 2). Bei der K06-Topologie wird beispielsweise das Lysin an Position 6 der Aminosäuresequenz mit einer -GG-Modifikation von 114 Da, die diesem Lysin zugesetzt wird, vor tryptischer Verdauung geschützt.
Die Identifizierung spezifischer vorbestimmter Peptide durch MS wird als gezielte Proteomik oder genauer gesagt als gezielte Peptidakquise10bezeichnet. Je nach Leistung des verwendeten Massenspektrometers wurden zwei Methoden entwickelt. Dabei handelt es sich um ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM), auch als Multiple Reaction Monitoring (MRM) und als parallele Reaktionsüberwachung (PRM) bezeichnet. SRM umfasst die Auswahl von Übergängen, die aus dem Vorläufer m/z und dem Produkt ion m/z bestehen. Umgekehrt benötigt PRM nur den Vorläufer m/z. Nach der Auswahl wird ein vollständiger Vermessungscan der Produktionen durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass vor der Messung11keine Auswahl geeigneter Produktionen zur Quantifizierung auf dem spezifischen Massenspektrometer erforderlich ist. Sowohl SRM als auch PRM können je nach Instrument geplant werden. Die Terminplanung ist die Praxis der Zuweisung eines Zeitfensters, in dem ein bestimmtes Ion zur Analyse einbezogen wird, da Peptide zu definierten Retentionszeiten aus dem chromatographischen System eluieren. Die Verringerung der Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt verhörten Ionen erhöht die Häufigkeit der Abfrage der zu diesem Zeitpunkt geplanten Ionen und verbessert so die Datengenauigkeit.
Im Allgemeinen ist die Anwendung der gezielten Proteomik für die Ubiquitin-Topologie die gleiche wie bei jedem anderen gezielten Proteomik-Experiment. Zwei wesentliche Unterschiede sind jedoch wichtig: Erstens muss die Stabilität von Ubiquitinketten berücksichtigt werden. Es gibt mehrere potente deubiquitinierende Enzyme (DUBs), die Ketten bei der Zelllyse schnell abbauen. Die ubiquitinspezifischen Proteasen lassen sich in zwei Kategorien einteilen: die Thioesterasen und die Metalloproteasen. Die meisten Der Ubiquitin-Hydrolasen sind Thioesterasen und tragen einen Cystein-Rückstand in ihrem aktiven Zentrum. Durch Alkylierung dieses Cysteinrückstandes können sie inaktiviert werden. Daher ist die Verwendung von Ubiquitin-Stabilisierungspuffern, die Alkylierungsmittel wie N-Ethylmaleimid (NEM) und hochdenaturierende Chemikalien enthalten, und die Kühlung von Proben von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Analyse. Zweitens ist die Peptidauswahl im Gegensatz zu anderen gezielten Experimenten fixiert. In einem typischen gezielten Experiment kann ein proteotypisches Peptid für eine gute chromatographische und ionisationsleistung ausgewählt werden. Für einige Topologie-charakteristische Peptide wie K48 sind diese Eigenschaften gut, während sie für andere weniger wünschenswert sind. Beispielsweise ist die K33-Chromatographie in einem typischen Reverse-Phase-Setup aufgrund der Bildung eines gestreckten Elutionsprofils schlecht, und die schlechten Ionisationseigenschaften des K27-Peptids reduzieren seine Sichtbarkeit um MS12.
In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Ubiquitin-Topologie-Bewertung einer biologischen Probe durch PRM durchgeführt wird. Beispieldaten für das Verfahren werden mit einer Störung des Proteasommittels mittels MG-132-Inhibitorbehandlung in verschiedenen Zelltypen dargestellt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

Die Bewertung des globalen Profils von Ubiquitin-Kettentopologien innerhalb eines Proteoms ist von Interesse, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu beantworten. Das hier skizzierte Protokoll nutzt die Di-Glylyin-Modifikation (-GG), die nach der tryptischen Verdauung von Ubiquitin in einer Kette zurückgelassen wurde. Durch quantifizieren diese topologie-charakteristischen Peptide kann die relative Häufigkeit jeder Ubiquitin-Kettentopologie bestimmt werden. Die Schritte, die erforderlich sind, um diese Peptide durch ein paralleles Reaktionsüberwachungsexperiment zu quantifizieren, werden unter Berücksichtigung der Stabilisierung von Ubiquitinketten berichtet. Die Vorbereitung von schweren Kontrollen, Zelllyse und Verdauung werden zusammen mit dem entsprechenden Massenspektrometer-Setup und Datenanalyse-Workflow beschrieben. Ein Beispieldatensatz mit Störungen in der Ubiquitin-Topologie wird vorgestellt, begleitet von Beispielen, wie sich die Optimierung des Protokolls auf die Ergebnisse auswirken kann. Durch Befolgen der beschriebenen Schritte kann ein Benutzer eine globale Bewertung der Ubiquitin-Topologie-Landschaft in seinem biologischen Kontext durchführen.

Um die Verwendung einer Ubiquitin-Kettenanalyse durch PRM zu demonstrieren, wurden drei Zelllinien ausgewählt: eine Mausmelanom-Zelllinie B16 und die beiden gemeinsamen menschlichen Zelllinien A549 (adenokarcinomische alveolische Alveolar-Basthelialzellen) und HeLa (Gebärmutterhalskrebszellen). Diese Kulturen wuchsen bis zur midexponentiellen Phase in geeigneten Medien, bevor sie mit 0, 10 oder 100 mM MG-132 für 4 h vor der Ernte behandelt wurden. MG-132 ist ein Proteasomen-Inhibitor, der den Abbau von ubiquitinkonjug...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.4K Aufrufe.  Luxembourg Institute of Health. Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Serie: Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Forschung

Biochemie

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

Echtzeit-Beobachtung der DNA-Strang Exchange Reaktion vermittelt durch Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Funktionelle Charakterisierung von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligases In Vitro und In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.

Isolierung und Analyse von Plasmalipoproteinen durch Ultrazentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.