Name: ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
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Die Autoren danken Céline Jeanty für ihre Unterstützung bei der Herstellung von Zellpellets mit DerBehandlung von MG-132, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben, und Elise Mommaerts für ihre Bereitstellung von E. coli Pellets, die im Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung eines schweren Peptidstandards
<ol><li>Je nach Lieferant und Qualität der gekauften schweren Peptide müssen die schweren Peptide verdünnt werden. Dieses Protokoll verwendete die in Tabelle 1berichteten Peptidsequenzen, wobei die C-terminale Aminosäure zu Lysin (13C615N2-lysin) oder Arginin (13C615N4-arginin) modifiziert wurde.<ol>
<li>Mischen Sie die schweren Peptide, verdünnen Sie die Mischung mit 50% Acetonitril (ACN), um eine Peptidmischung mit jedem Peptid bei 10 M zu erstellen.</li>
		<li>Aliquots des Peptid-Mixes erstellen und bei -80 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Beispiellyse HINWEIS: Die Stabilität von Ubiquitinketten muss bei der Probenvorbereitung berücksichtigt werden. Biologische Proben und Puffer bei 4 °C gekühlt aufbewahren und Proben so schnell wie möglich in den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer aufnehmen.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 1 M NH4HCO3 (Ammoniumbicarbonat) in Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8 ein.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung von 200 mM N-Ethylmaleimid (NEM) in Wasser vor.</li>
		<li>Bereiten Sie den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer mit 8 M Harnstoff in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM vor. Ubiquitin-Stabilisierungspuffer muss jedes Mal frisch zubereitet werden. HINWEIS: Eine 5 ml Lösung von 8 M Harnstoff benötigt bei der Ausdehnung des Wassers in einer gesättigten Lösung mit Harnstoff deutlich weniger als 5 ml Wasser. VORSICHT: Bereiten Sie den Puffer nicht über 50 °C vor, da Harnstoff bei hohen Temperaturen zu Polyurea neigt.</li>
		<li>Setzen Sie die biologische Probe, die im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer untersucht werden soll, mit dem Ziel von 0,5 g/l Protein, und limieren Sie die Zellen mit einer geeigneten Methode für die Probe. Für die Zelllinien in diesem Protokoll wurde eine Beschallungsmethode mit drei 10 s Impulsen mit einem SFX 150 Branson Sonifier mit 70% Intensität und 10 s Brüchen auf Eis zwischen jedem Puls verwendet.</li>
		<li>Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.</li>
		<li>Überstand auf ein frisches, proteinarmes Mikrozentrifugenrohr übertragen. Proben können bei Bedarf bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Proben und Kontrollen
	<ol>
<li>Wenn die Proben eingefroren sind, mischen Sie (z.B. mit einem Thermomixer), während sie aufgetaut werden, um den Harnstoff schnell aufzulösen. VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.</li>
		<li>Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.</li>
		<li>Übertragen Sie 20 g Probe in ein frisches, bindendes Mikrozentrifugenrohr und stellen Sie das Volumen mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer auf 50 l ein.</li>
		<li>Erstellen Sie einen negativen Kontrollwert mit einem normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l). In dieser Probe sollte keine leichte Version jedes Peptids vorhanden sein, so dass eine leichte Kontamination durch die spike-in schweren Peptide beobachtet werden kann. Diese negative Kontrolle wurde auch für die Aufbewahrungszeitplanung des in Abschnitt 3.1 beschriebenen PRM verwendet.</li>
		<li>Eine positive Steuerung wurde auch mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und der Zugabe kommerziell erhältlicher Kettentypen zum normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l) geschaffen. Häufig sind K63, K48 und M1 verfügbar. In den repräsentativen Ergebnissen wurden 20 ng von K48, K63 und M1 verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Reduktion, Alkylierung und Verdauung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 50 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) in Wasser vor und stellen Sie die Probe mit 1 M NaOH auf pH = 8 ein.</li>
		<li>Eine Kultur von E. coli, die in LB-Brühe angebaut wurde, wurde 5.000 x g für 5 min zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden, das dann 2x mit PBS gewaschen wurde, bevor es im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer bei 5 g/l wieder aufsuspension wurde.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Probe und Kontrolle 1 g E. coli Lysat hinzu. Dieses Protokoll verwendet E. coli (DH10B), aber jedes komplexe Lysat ohne Ubiquitin kann verwendet werden. Beachten Sie, dass Ubiquitin allen Eukaryoten gemeinsam ist. HINWEIS: Die Verwendung einer E. coli Lysat-Matrix reduziert den Verlust von Peptiden aufgrund der unspezifischen Haftung an Kunststoffen. Dies ist besonders auffällig bei der Negativkontrolle oder bei Proben mit begrenztem Proteingehalt und hat einen starken Einfluss auf die Beobachtung von K6312.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung aus 500 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) in MS-Wasser (DTT kann als Alternative verwendet werden).</li>
		<li>Reduzieren Sie die Proben und Kontrollen durch Zugabe von TCEP auf eine Endkonzentration von 50 mM. Wirbel kurz vor der Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Bei Verwendung von DTT muss die Temperatur auf 50 °C erhöht werden. VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung von 550 mM Chloroacetamide (CAA) in NH4HCO3vor. Im Dunkeln lagern.</li>
		<li>Alkyliern Sie die Proben und Kontrollen, indem Sie CAA zu einer Endkonzentration von 55 mM hinzufügen. Wirbel kurz vor der Inkubation für 20 min bei RT im Dunkeln. HINWEIS: CAA wird anstelle von Iodoacetamid als Reduktionsmittel verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer doppelten Carbamidmethylmodifikation (114.0429) an einem Lysinrückstand zu verringern, der mit einer -GG-Modifikation verwechselt wird (114.0429)13.</li>
		<li>Fügen Sie endopeptidase LysC zu den Proben bei 1:25 (w/w) Verhältnis zum Proteingehalt hinzu. 3 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Proben und Kontrollen mit 200 l von 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Fügen Sie Trypsin den Proben im Verhältnis 1:25 w/w zum Proteingehalt hinzu. 12 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10% Ameisensäure (FA) Lösung in MS-Grade-Wasser in einem Verhältnis von 1:10 v/v zu jeder Probe und Kontrollprobe hinzu. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert <3) vor der C18-Bereinigung ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Ameisensäure hinzu.</li>
		<li>Zu jeder Probe und Kontrolle fügen Sie 0,5 l des schweren Peptidstandards hinzu, der in Abschnitt 1 erstellt wurde.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptid-Reinigung
	<ol>
<li>Mehrere Hersteller bieten C18 Reinigungsspitzen oder Platten an. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das verwendete Produkt und trockene eluierte Peptide in einer Vakuumzentrifuge, die für die MS-Analyse bereit ist.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse durch LC-MS/MS
<ol><li>Führen Sie eine erste PRM-Analyse auf den schweren Peptidstandard in einer ungeplanten Weise durch.<ol>
<li>Setzen Sie die getrockneten Proben in 10 l MS-Ladepuffer 2% ACN/0,05% Trifluoressigsäure (TFA) wieder auf.</li>
		<li>Rüsten Sie einen HPLC mit einer Analysesäule der Kehrphase C18 (75 x 15 cm, 2 m 100 c18 Perlen) für Nanofluss MS aus. Bilden Sie lineare Gradienten, die MS-Wasser austauschen, ergänzt mit 0,1% FA mit ACN mit 0,1% FA. Hier wurde eine Opferfalle-Säule (75 x 2 cm, 3 m, 100 c18 Perlen) verwendet, um die Lebensdauer der analytischen Säule zu erhalten, ist aber nicht erforderlich.</li>
		<li>Koppeln Sie die Ausgabe der analytischen Säule mit einer Nano-ESI-Quelle auf einem hochauflösenden Massenspektrometer.</li>
		<li>Verwenden Sie eine geeignete gezielte Proteomik-Methode für das Massenspektrometer. Beispiel: Bei einer Q-Exactive plus einer Zwei-Experiment-Methode zwischen einem Full MS und einem PRM-Experiment. Für das Full MS-Experiment wurde eine Auflösung von 120.000 mit einem AGC-Ziel von 1e6 und 240 ms als Maximale IT verwendet. Für das PRM-Experiment wurde das gleiche AGC-Ziel und die maximale IT mit einer niedrigeren Auflösung von 60.000 und einem Isolationsfenster von 1,2 m/z verwendet.</li>
		<li>Mit dem HPLC-Autosampler 200 ng der Negativkontrolle in die analytische Säule injizieren. Wenden Sie einen linearen Gradienten auf die Probe auf die analytische Spalte an, wodurch die ACN-Konzentration über einen Zeitraum von 45 min von 2–25 % erhöht wird. HINWEIS: Die 25% ACN-Konzentration ist niedriger als üblich für Proteomik aufgrund der geringen hydrophilen Natur der typischen Ubiquitin-Topologie-charakteristischen Peptide. Wenn andere Peptide quantifiziert werden sollen, kann eine höhere ACN-Konzentration gewünscht werden, um eine gute Zieltrennung zu erreichen.</li>
		<li>Analysieren Sie die Ergebnisse des Planungslaufs wie in Abschnitt 4.2 beschrieben, um eine Liste mit geplanter Einschlussaufnahme zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse der Proben<ol>
<li>Führen Sie die verbleibenden Beispiele, wie für die Planung in 3.1 beschrieben, aus, abgesehen von der Verwendung der in Abschnitt 4.2 erstellten Liste für geplante Einschlusse. HINWEIS: Nach dem Positivsteuerelement muss ein Leerzeichen ausgeführt werden, um sicherzustellen, dass in nachfolgenden Stichproben keine Übertragung vom vorherigen Lauf erkannt wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Softwareanalyse
<ol><li>Erstellen Sie eine Einschlussliste mit geeigneten Formatierungen für die verwendete MS. Dieses Protokoll verwendet die Open-Source-Software Skyline (Version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), die gut dokumentierte Unterstützung und Hilfe bietet. Mithilfe der Exportisolationslistenfunktion kann eine Einschlussliste für mehrere Massenspektrometer erstellt werden.<ol>
<li>Öffnen Sie ein neues Skyline-Dokument.</li>
		<li>Wählen Sie schwere Isotopenmodifikationen entsprechend schweren Topologie-charakteristischen Peptiden aus. In den Einstellungen| Peptideinstellungen unter der Registerkarte Änderung, klicken Sie auf das Namensfeld, um die mögliche Änderung zu sehen. Die Auswahl basiert auf dem Isotopenzustand der gekauften schweren Peptide. In diesem Beispiel wurden synthetische Peptide verwendet, die entweder ein schweres Lysin (13C615N2-lysin) oder ein schweres Arginin (13C615N4-arginin) am C-Terminus trugen. Geeignete Bezeichnungen wären: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" und "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Wählen Sie Einstellungen aus| Übergang. Unter der Registerkarte Filter enthalten Precursor Charges 2, 3, 4.</li>
		<li>Peptide einfügen, indem Sie Bearbeiten auswählen| Einfügen| Peptide.</li>
		<li>Füllen Sie die relevanten Felder einschließlich der topologie-charakteristischen Peptidsequenz und eines Proteinnamens (z. B. "Chain–K63") aus.</li>
		<li>Erweitern Sie jedes Peptid, das jetzt im Bedienfeld "Ziele" angezeigt wird. Löschen Sie unerwünschte Ladezustände. Der bevorzugte Ladezustand und die Kollisionsenergie, die je nach verwendetem Massenspektrometer unterschiedlich sein können, ist für jedes topologiecharakteristische Peptid in Tabelle 1dargestellt.</li>
		<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Sequenz und wählen Sie Ändern. Fügen Sie ein GG als strukturelle Änderung hinzu, indem Sie auf das Namensfeld klicken und <Alle anzeigenauswählen ... > bevor Sie "GlyGly (K)" auswählen.</li>
		<li>Exportieren Sie die Isolationsliste Datei| Export| Isolationsliste, wählen Sie den Instrumententyp aus, und legen Sie den Methodentyp auf Standardfest. Wenn Sie OK auswählen, wird eine Eingabeaufforderung zum Speichern einer *.csv Datei geöffnet, die zum Erstellen einer PRM-Methode verwendet werden kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellen Sie eine geplante Inklusionsliste basierend auf einem schweren Peptid-Scheduling-Lauf, der hier mit der Open-Source-Skyline-Software erläutert wird.<ol>
<li>Erstellen Sie eine Zielliste, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.</li>
		<li>Importieren Sie den Planungslauf in 3.1, indem Sie Datei auswählen| Import| Ergebnisse.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Kennungen. Das schwere Signal für jedes Peptid ist beobachtbar, indem man auf die Masse für jeden schweren Peptideintrag klickt. Die korrekte Erkennung der Spitze wird oft automatisch bestimmt, aber die Software kann eine manuelle Kuration erfordern, indem Sie die Spitze per Klick und Ziehen unter der x-Achse auswählen.</li>
		<li>Retentionszeiten, die für die schweren Varianten ausgewählt wurden, werden auch auf die Lichtversionen angewendet, wodurch ein Zeitplan für das PRM erstellt wird. Das Planungsfenster kann unter Einstellungen geändert werden| Peptideinstellungen mithilfe der Registerkarte Vorhersage, indem Sie das Zeitfensterändern.</li>
		<li>Eine geplante Einschlussliste kann nun mit File exportiert werden| Export| Isolationsliste und Auswahl des entsprechenden Instrumententyps und Einstellungsmethodentyps auf Geplant.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie die Daten.<ol>
<li>Importieren Sie die Stichproben auf die gleiche Weise wie für die Planungslaufanalyse in Abschnitt 4.2.</li>
		<li>Nach dem vollständigen Import aller Proben wird die Kuration der Übergänge empfohlen. Dies ist der Prozess, durch den Übergänge mit Interferenzen oder schlechten Signal-Rausch-Verhältnissen entfernt werden. Ein Beispiel für ein Chromatogramm vor und nach der Kuration ist in Abbildung 4dargestellt.</li>
		<li>Die Daten können nun entweder exportiert werden, indem Sie mit der rechten Maustaste auf relevante Diagramme klicken und Daten kopieren auswählen oder indem Sie Datei auswählen| Export| Ergebnisse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Die Analyse des Ubiquitinzustandes innerhalb eines Proteoms gewinnt für eine Vielzahl biologischer Fragen zunehmend an Bedeutung. Die Beschreibung des Ubiquitinationszustands einer Probe muss sich nicht nur auf das Profil der ubiquitinierten Proteine konzentrieren, sondern auch auf die Topologie einer solchen Ubiquitination. Die Bewertung dieser Topologie durch gezielte MS, wie hier beschrieben, spielt eine Rolle in einer Vielzahl biologischer Untersuchungen.
Es sollte verstanden werden, dass...

Die enge Regulierung der Proteinfunktion und -stabilität ist von größter Bedeutung, da sie wichtige Treiber der phätotypischen Kontrolle der Biologie sind. Die Funktion eines Proteins besteht aus zwei Komponenten: seiner intrinsischen Polypeptidsequenz und allen posttranslationalen Modifikationen (PTMs). Verschiedene chemische PTMs wurden identifiziert, einschließlich Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung1. 1975 identifizierten Goldstein et al.2 ein kleines Protein und nannten es aufgrund seiner allgegenwärtigen Natur Ubiquitin. Ubiquitin erwies sich als wichtig für den Proteinabbau3. Seitdem steht jedoch fest, dass die Funktion von Ubiquitin als Signalmolekül weit über die Regulierung der Proteinstabilität hinausgeht. Ubiquitin Signalisierung ist in einer Vielzahl von anderen biologischen Funktionen beteiligt, wie Proteinstabilisierung, Autophagie, Zellzykluskontrolle, und Proteinhandel4.
Während andere PTMs im Allgemeinen binär sind (d. h., das Protein wird modifiziert oder unverändert gelassen) für eine bestimmte Stelle, kann Ubiquitin ein Protein sowohl als Monomer oder als polymere Kette modifizieren, wobei das angefügte Ubiquitin selbst ubiquitiniert ist. Darüber hinaus kann sich diese Polyubiquitinationskette in mehreren Topologien mit der Ubiquitination des vorherigen Ubiquitins entwickeln, das an einer von acht Verknüpfungsstellen5,6anhängt. Ubiquitin wird durch einen mehrstufigen enzymatischen Prozess übertragen (Abbildung 1), bei dem der C-Terminus von Ubiquitin mit einem seiner sieben Lysinrückstände (K06, K11, K27, K29, K33, K48 oder K63) oder dem N-Terminal des vorherigen Ubiquitins (als M1 oder lineare Ubiquitination bezeichnet)5,6verbunden ist. Diese Kettentopologie ist der Schlüssel zum Schicksal des Proteins, das verändert wird. Beispielsweise führt die Modifikation mit einer K48 oder K11-Verbindungskette zum Abbau des modifizierten Proteins am Proteasom, während eine lineare Kette für die Aktivierung der NF-kB-Signalisierung notwendig ist. Daher ist die relative Verteilung dieser Kettentopologien für eine Vielzahl biologischer Fragen relevant.
Die Verwendung der Massenspektrometrie (MS) ist von besonderem Nutzen für die Analyse der Ubiquitin-Kettentopologie, da sie nicht auf antikörperbasierte oder affinitätsbasierte Wechselwirkungen7,8angewiesen ist, von denen viele eine begrenzte Spezifität aufweisen und nicht zwischen den verschiedenen Kettentypen unterscheiden. Eine andere Nachweismöglichkeit besteht darin, genetisch veränderte Ubiquitin-Mutationen zu verwenden. Hier wird ein bestimmtes Lysin gegen Arginin ausgetauscht, das die Modifikation durch Ubiquitin nicht unterstützen kann. Der Mangel an Ubiquitin-Kettenbildung auf dem Substratprotein wird dann als Beweis für eine spezifische Topologieinterpretiert 9.
Die MS-basierte Identifizierung ubiquitinierter Proteine basiert auf der Tatsache, dass der C-Terminus von Ubiquitin einen Argininrückstand in Position 74 enthält, der von Trypsin während der proteolytischen Vorbereitung der Proben für die MS-Analyse erkannt wird und das C-terminale Doppelglycin trennt. Dieses GlyGly (-GG) bleibt an der ε-Amino-Gruppe des Lysinrückstands des Substratproteins befestigt. Für die Ubiquitin-Topologie-Analyse erfolgt die Modifikation an einem der sieben Lysinrückstände von Ubiquitin. Dadurch wird ein Satz von sieben Schlüsselpeptiden erstellt, die einen Lysinrückstand tragen, der durch GG modifiziert wird, spezifisch für jede der Topologien (Abbildung 2). Bei der K06-Topologie wird beispielsweise das Lysin an Position 6 der Aminosäuresequenz mit einer -GG-Modifikation von 114 Da, die diesem Lysin zugesetzt wird, vor tryptischer Verdauung geschützt.
Die Identifizierung spezifischer vorbestimmter Peptide durch MS wird als gezielte Proteomik oder genauer gesagt als gezielte Peptidakquise10bezeichnet. Je nach Leistung des verwendeten Massenspektrometers wurden zwei Methoden entwickelt. Dabei handelt es sich um ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM), auch als Multiple Reaction Monitoring (MRM) und als parallele Reaktionsüberwachung (PRM) bezeichnet. SRM umfasst die Auswahl von Übergängen, die aus dem Vorläufer m/z und dem Produkt ion m/z bestehen. Umgekehrt benötigt PRM nur den Vorläufer m/z. Nach der Auswahl wird ein vollständiger Vermessungscan der Produktionen durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass vor der Messung11keine Auswahl geeigneter Produktionen zur Quantifizierung auf dem spezifischen Massenspektrometer erforderlich ist. Sowohl SRM als auch PRM können je nach Instrument geplant werden. Die Terminplanung ist die Praxis der Zuweisung eines Zeitfensters, in dem ein bestimmtes Ion zur Analyse einbezogen wird, da Peptide zu definierten Retentionszeiten aus dem chromatographischen System eluieren. Die Verringerung der Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt verhörten Ionen erhöht die Häufigkeit der Abfrage der zu diesem Zeitpunkt geplanten Ionen und verbessert so die Datengenauigkeit.
Im Allgemeinen ist die Anwendung der gezielten Proteomik für die Ubiquitin-Topologie die gleiche wie bei jedem anderen gezielten Proteomik-Experiment. Zwei wesentliche Unterschiede sind jedoch wichtig: Erstens muss die Stabilität von Ubiquitinketten berücksichtigt werden. Es gibt mehrere potente deubiquitinierende Enzyme (DUBs), die Ketten bei der Zelllyse schnell abbauen. Die ubiquitinspezifischen Proteasen lassen sich in zwei Kategorien einteilen: die Thioesterasen und die Metalloproteasen. Die meisten Der Ubiquitin-Hydrolasen sind Thioesterasen und tragen einen Cystein-Rückstand in ihrem aktiven Zentrum. Durch Alkylierung dieses Cysteinrückstandes können sie inaktiviert werden. Daher ist die Verwendung von Ubiquitin-Stabilisierungspuffern, die Alkylierungsmittel wie N-Ethylmaleimid (NEM) und hochdenaturierende Chemikalien enthalten, und die Kühlung von Proben von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Analyse. Zweitens ist die Peptidauswahl im Gegensatz zu anderen gezielten Experimenten fixiert. In einem typischen gezielten Experiment kann ein proteotypisches Peptid für eine gute chromatographische und ionisationsleistung ausgewählt werden. Für einige Topologie-charakteristische Peptide wie K48 sind diese Eigenschaften gut, während sie für andere weniger wünschenswert sind. Beispielsweise ist die K33-Chromatographie in einem typischen Reverse-Phase-Setup aufgrund der Bildung eines gestreckten Elutionsprofils schlecht, und die schlechten Ionisationseigenschaften des K27-Peptids reduzieren seine Sichtbarkeit um MS12.
In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Ubiquitin-Topologie-Bewertung einer biologischen Probe durch PRM durchgeführt wird. Beispieldaten für das Verfahren werden mit einer Störung des Proteasommittels mittels MG-132-Inhibitorbehandlung in verschiedenen Zelltypen dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

Die Bewertung des globalen Profils von Ubiquitin-Kettentopologien innerhalb eines Proteoms ist von Interesse, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu beantworten. Das hier skizzierte Protokoll nutzt die Di-Glylyin-Modifikation (-GG), die nach der tryptischen Verdauung von Ubiquitin in einer Kette zurückgelassen wurde. Durch quantifizieren diese topologie-charakteristischen Peptide kann die relative Häufigkeit jeder Ubiquitin-Kettentopologie bestimmt werden. Die Schritte, die erforderlich sind, um diese Peptide durch ein paralleles Reaktionsüberwachungsexperiment zu quantifizieren, werden unter Berücksichtigung der Stabilisierung von Ubiquitinketten berichtet. Die Vorbereitung von schweren Kontrollen, Zelllyse und Verdauung werden zusammen mit dem entsprechenden Massenspektrometer-Setup und Datenanalyse-Workflow beschrieben. Ein Beispieldatensatz mit Störungen in der Ubiquitin-Topologie wird vorgestellt, begleitet von Beispielen, wie sich die Optimierung des Protokolls auf die Ergebnisse auswirken kann. Durch Befolgen der beschriebenen Schritte kann ein Benutzer eine globale Bewertung der Ubiquitin-Topologie-Landschaft in seinem biologischen Kontext durchführen.

Um die Verwendung einer Ubiquitin-Kettenanalyse durch PRM zu demonstrieren, wurden drei Zelllinien ausgewählt: eine Mausmelanom-Zelllinie B16 und die beiden gemeinsamen menschlichen Zelllinien A549 (adenokarcinomische alveolische Alveolar-Basthelialzellen) und HeLa (Gebärmutterhalskrebszellen). Diese Kulturen wuchsen bis zur midexponentiellen Phase in geeigneten Medien, bevor sie mit 0, 10 oder 100 mM MG-132 für 4 h vor der Ernte behandelt wurden. MG-132 ist ein Proteasomen-Inhibitor, der den Abbau von ubiquitinkonjug...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K Aufrufe.  Luxembourg Institute of Health. Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Serie: Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Forschung

Biochemie

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologie

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Beurteilung von DUB-Varianten bei neurologischen Entwicklungsstörungen mit Hilfe eines Spaltungsassays

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassa

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Neurowissenschaften

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Detektion von Protein Ubiquitination

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben