Um mit dem Western Blot der normalisierten verdauten DNA-Proben zu beginnen, fügen Sie 4X Laemmli-Probenpuffer hinzu und kochen Sie die Probe fünf Minuten lang. Laden Sie fünf bis sechs Mikrogramm der aufgeschlossenen Probe auf 4 bis 20 % Polyacrylamid-Gel und führen Sie SDS-PAGE durch, um unmodifizierte und posttranslationale Modifikationen oder PMT-konjugierte DPCs aufzulösen. Inkubieren Sie das Gel mit Coomassie-Blaufärbung über Nacht bei Raumtemperatur.
Waschen Sie das Gel vor der Bildaufnahme zwei Stunden lang mit doppelt destilliertem Wasser. Um Ubiquitylierung, SUMO-1- oder SUMO-2- und SUMO-3-Modifikation, ADP-Ribosylierung, Gesamt-TOP1-, TOP2-alpha- oder TOP2-beta-DPCs nachzuweisen, verdünnen Sie die entsprechenden Antikörper wie in der Tabelle gezeigt. Als nächstes wird das Gel in eine geeignete Verdünnung des primären Antikörpers in Blockierungspuffer überführt und die Membranen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.
Anschließend wird die PBST-gewaschene Membran mit einem Sekundärantikörper, der 5.000-fach in Blockierungspuffer verdünnt ist, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Membran mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Reagenz entwickelt wird. Erfassen Sie ein Bild mit dem Imaging-System. Die Camptothecin-Exposition induzierte die Bildung von TOP1 DPCs.
Die Bildung von TOP1 DPCs erreichte ihren Höhepunkt nach 20 Minuten Camptothecin-Exposition, ähnlich wie bei der Anti-SUMO-2- und -3-Modifikation. Die Kulmination der SUMO-1-Modifikation und Ubiquitylierung wurde ebenfalls beobachtet. DPCs und ihre SUMO-2- und 3-TOP1-Modifikationen nahmen in Abhängigkeit von der Camptothecin-Dosis ab.
Die Adipozyten-induzierten TOP2-DPCs und die SUMO-2- und SUMO-3-Modifikation erreichten nach 20 Minuten ihren Höhepunkt und nahmen dann ab. Im Vergleich dazu erreichten die SUMO-1- und Ubiquitin-Modifikationen ihren Höhepunkt bei 60 Minuten. Die Formaldehyd-induzierten DPCs und ihre SUMO-2 und 3, SUMO-1 und Ubiquitylierung bildeten und akkumulierten dosisabhängig.
Der quantitative Nachweis der PARylierung von TOP1 DPCs unter Verwendung eines Anti-PAR-Antikörpers, die TOP1 DPC PARylierung, war nicht nachweisbar, es sei denn, der Zelle wurde ein PARP-Inhibitor zugesetzt, was darauf hindeutet, dass die PARylierung schnell transpiriert und hochdynamisch ist.
