Nehmen Sie zunächst das Pellet der GFP-HUVECs, die auf ein Konfluenzniveau von 80 bis 100 % gewachsen sind, und resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen Basalmedium, um eine Konzentration von einmal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter Stammlösung zu erreichen. Bereiten Sie konische 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor, die das erforderliche Volumen an Basalmedium enthalten, ergänzt mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren. Geben Sie die GFP-HUVECs aus der Stammlösung in einer Verdünnung von eins bis 66,67 hinzu, um eine Konzentration von 1,5 mal 10 bis fünf Zellen pro Mikroliter zu erreichen.
Anschließend wird das Medium von der Platte, die die stromale Monokultur enthält, abgesaugt und 200 Mikroliter der vorbereiteten GFP-HUVECs-Suspension pro Vertiefung hinzugefügt. Bei 37 Grad Celsius in 5%igem Kohlendioxid in befeuchteter Atmosphäre inkubieren, dabei das Medium alle drei bis vier Tage wechseln. Überwachen Sie die Entwicklung der Kultur mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie mit einem Fünffach-Objektiv.
Unterschiede zwischen den Kulturen konnten anhand der Hellfeld- und Fluoreszenzbilder beobachtet werden, die nur die GFP-HUVECs zeigten. Die Kulturen schienen ohne Wachstumsfaktor weniger entwickelt zu sein, jedoch wurde in Gegenwart von FGF-2 eine schnellere Entwicklung beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten die Hellfeldbilder die dichtesten Kulturen in Gegenwart von BMP-2.
Mit FGF-2 bildeten sich jedoch vaskuläre Netzwerke, die sowohl Wachstumsfaktor-haltige Bedingungen als auch die umfangreichsten und miteinander verbundenen Netzwerke bildeten.
