Beginnen Sie mit dem Mischen und Aliquotieren von 90 bis 120 Mikrolitern der mit Formaldehyd vernetzten C.elegans-Proben in ein Styropor-Ultraschallröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen Resuspensionspuffer hinzu, der 2X Detergenzien enthält. Beschallen Sie das Gerät sieben Minuten lang in einem Wasserbad.
Mischen Sie die Probe vorsichtig durch Pipettieren und wiederholen Sie die Beschallung für weitere sieben Minuten. Sobald dies erledigt ist, überführen Sie das beschallte Lysat in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie ein halbes Volumen Resuspensionspuffer ohne Reinigungsmittel hinzu.
Nach Zentrifugation bei 13.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius wird der Lysatüberstand in vier Teile geteilt. Lagern Sie den Eingangslysatteil bei minus 20 Grad Celsius in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. 0,5 Mikrogramm Anti-H3K9-Trimethylierung, Anti-Histon-H3 oder IgG in die entsprechende Immunpräzipitations- oder IP-Probe geben.
Die Reaktion bei vier Grad Celsius über Nacht mit Rotation inkubieren. Am nächsten Tag werden die neun Mikroliter Protein-G-beschichteten Magnetkügelchen pro IP-Probe in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen aliquotiert. Nach zwei Wäschen mit einem Milliliter FA-150 werden die magnetischen Kügelchen wieder in den FA-150-Puffer versetzt.
Wenn Sie fertig sind, fügen Sie 7,5 Mikroliter der magnetischen Bead-Suspension zu jeder IP-Antikörpermischung hinzu, bevor Sie die Röhrchen zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius mit Rotation inkubieren. Als nächstes waschen Sie die magnetischen Kügelchen siebenmal mit mindestens 200 Mikrolitern jeder Pufferlösung. Inkubieren Sie jede Wäsche fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Rotation, bevor Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer sammeln, um die Wäsche anzusaugen.
Nach dem Absaugen der letzten Wäsche des Puffers werden die magnetischen Kügelchen in 50 Mikroliter Chromatin-IP-Elutionspuffer resuspendiert und in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Nachdem Sie die Probe in einem ThermoMixer eluiert haben, sammeln Sie die Kügelchen auf einem magnetischen Ständer und übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie die Elution mit weiteren 50 Mikrolitern Chromatin-Immunpräzipitations-Elutionspuffer.
Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie insgesamt 100 Mikroliter Überstand, bevor Sie mit der umgekehrten Vernetzung und DNA-Elution fortfahren.
