Zu Beginn pipettieren Sie 3,75 Milliliter reduziertes Serummedium in ein Röhrchen mit der Bezeichnung A und verdünnen Sie das Medium mit 105 Mikrolitern des Transfektionsreagenzes. Den Inhalt des Röhrchens vorziehen, um ihn gut zu vermischen. Als nächstes werden 3,75 Milliliter des reduzierten Serummediums in ein Röhrchen mit der Bezeichnung B gegeben. Verdünnen Sie die Expressionsplasmide mit 90 Mikrolitern Enhancer-Reagenz.
Geben Sie nun den Inhalt des Röhrchens A in das Röhrchen B und pipettieren Sie die Lösung, um sie vor der Inkubation gut zu mischen. Entnehmen Sie vorsichtig 10 Milliliter Zellkulturmedien von einer vorbereiteten Phoenix Eco-Platte. Geben Sie dann das gesamte Volumen der Transfektionsmischung tropfenweise auf die Platte.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator. Geben Sie MTCM virales Erntemedium in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um es vorzuwärmen. Kippen Sie nun die Phoenix Eco-Platte und pipettieren Sie das Nährmedium heraus.
Als nächstes pipettieren Sie 30 Milliliter des vorgewärmten viralen Erntemediums langsam in die gekippte Platte. Legen Sie die Zellen zurück in den Inkubator. Nach 48 Stunden Transfektion wird der virale Überstand geerntet.
Filtern Sie es durch 0,45-Mikrometer-PVDF-Filter. Mit der Rückseite einer sterilen Spritze wird isolierte Milz von Mäusen durch ein 70 bis 100 Mikrometer großes Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zerkleinert. Waschen Sie dann das Sieb mit fünf Millilitern T-Zell-Isolationspuffer.
Nachdem Sie das endgültige Volumen der Zellen auf 50 Milliliter gebracht haben, zählen Sie die Zellen mit dem Hämozytometer. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 450 G bei vier Grad Celsius oder bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit den Splenozyten mit dem empfohlenen T-Zell-Isolierungskit.
Anschließend werden die CD3-positiven T-Zellen mittels negativer Selektion isoliert. Das magnetisch getrennte Isolat wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Überprüfen Sie die Zellenanzahl erneut.
Die isolierten T-Zellen werden 10 Minuten lang bei 450 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Anschließend wird das Zellpellet in MTCM-Aktivierungsmedium resuspendiert. Geben Sie nun antikörperbeschichtete Magnetkügelchen und Interleukin-2 in die Zellsuspension, um die T-Zellen zu aktivieren.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am Tag Null werden unbehandelte sterile 24-Well-Platten mit 0,5 Millilitern humanem Fibronektin-Transduktionsverstärker-Reagenz vorbeschichtet. Lagern Sie die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie am nächsten Tag das Transduktionsreagenz aus den Vertiefungen. Blockieren Sie die Vertiefungen mit einer gleichen Menge steril gefilterter BSA-ergänzter PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Inkubation das BSA PBS und waschen Sie die Vertiefungen mit 0,5 bis einem Milliliter PBS.
Als nächstes geben Sie einen Milliliter des sauberen Retrovirus in jede vorbeschichtete Vertiefung. Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 G 90 Minuten lang bei 32 Grad Celsius. Geben Sie dann einen Milliliter der aktivierten T-Zellen in jede viral beladene Welle.
Die Platten werden erneut bei 450 g für 10 Minuten bei 32 Grad Celsius zentrifugiert. Die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am fünften Tag werden die Zellen erneut suspendiert, um die aktivierten T-Zellen von den mit Antikörpern beschichteten Kügelchen zu trennen.
Platzieren Sie die Zellaufhängung für 30 Sekunden auf einem Magneten. Anschließend wird die Suspension in ein Ex-vivo-Kulturgefäß überführt. Legen Sie die Gefäße vor der durchflusszytometrischen Analyse bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator.
Die Verwendung des T-Zell-Isolierungskits ergab T-Zell-Reinheiten von weniger als 98 % vor der Transduktion. Reproduzierbare CAR-Expressionsraten von 65 bis 75% wurden erreicht. Ex vivo Kulturen mit Interleukin-7 und 15 führten zu einer 15-fachen bis Tag 10 Postaktivierung aus einer einzelnen Milz.
Die Kultur der T-Zellen mit den Interleukinen führte zu vergleichbaren CD8-positiven und CD4-positiven T-Zell-Frequenzen. Nach 10 Tagen Ex-vivo-Kultur wurde beobachtet, dass die Stammzellgedächtnispopulationen erhalten blieben.
