Um mit der Isolierung einzelner Zellen aus den Magenbiopsien zu beginnen, die während der oberen Endoskopie des Patienten entnommen wurden, lassen Sie zunächst das Gewebe am Boden eines konischen 15-Milliliter-Röhrchens absetzen. Nach dem Absetzen verwenden Sie eine Pipette, um das Medium anzusaugen, und waschen Sie die Biopsien zweimal mit einem Milliliter antibiotikahaltigem PBS. Übertragen Sie mindestens 20 Milligramm des Gewebes in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter PBS enthält, das mit DTT ergänzt ist.
Schneiden Sie das Gewebe mit einer feinen Präparierschere in Stücke, die ein bis zwei Millimeter oder kleiner sind. Verwenden Sie eine Tisch-Minizentrifuge für 15 Sekunden, um die Gewebestücke am Boden des Röhrchens zu aggregieren, und saugen Sie dann so viel Überstand wie möglich ab. Geben Sie fünf Milliliter frisch erwärmten Aufschlusspuffer in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Übertragen Sie 500 Mikroliter des Puffers aus diesem Röhrchen in das 1,5-Milliliter-Röhrchen, das die Gewebestücke enthält. Schneiden Sie dann mit einer Schere die Pipettenspitze von unten auf 1.000 Mikroliter ab, um den Durchmesser der Spitze zu vergrößern und den Gewebeverlust zu minimieren. Übertragen Sie nun mit der modifizierten Pipettenspitze die kleinen Gewebestücke aus dem 1,5-Milliliter-Röhrchen in den Aufschlusspuffer im 50-Milliliter-Röhrchen.
Inkubieren Sie den Verdauungspuffer und die Gewebemischung bei 37 Grad für 30 Minuten mit orbitalem Schütteln bei 200 U/min. Dann werden fünf Milliliter erwärmtes Trypsin mit 0,25 % EDTA in das Gewebe im Verdauungspuffer gegeben und inkubiert. Neutralisieren Sie den Aufschlusspuffer und das Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen fortschrittlichen DMEM/F-12-Mediums hinzufügen und die Suspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb leiten.
