펜실베니아 대학교 게놈 의학 T32 HG009495(KHB), NCI R21 CA267949(BWK), BRCA Basser Center for BRCA의 남성 및 BRCA 프로그램(KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award(BWK).

이 프로토콜에 사용된 모든 인체 조직은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(IRB #842961)에서 승인한 위 조직 수집 연구를 통해 조직 수집에 대한 정보에 입각한 동의를 제공한 개인으로부터 수집되었습니다. 이 연구의 참가자는 일상적인 치료의 일환으로 상부 내시경 검사를 받아야 하고 18세 이상이어야 하며 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있어야 했습니다. 수행된 모든 연구는 펜실베니아 대학교에서 정한 지침을 준수했습니다.
1. 실험 준비
<ol><li>앞서 설명한 대로 컨디셔닝된 L-WRN 매체를 준비합니다16. 필수는 아니지만 컨디셔닝된 배지에 포함된 Wnt-3A, R-spondin 및 noggin의 농도는 제조업체의 지침에 따라 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 확인할 수 있습니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>RPMI-항생제(RPMI-ABX), PBS-항생제(PBS-ABX), PBS-디티오트레이톨(PBS-DTT), 분해 완충액 및 위 오가노이드 배지를 준비합니다(세부 조성은 보충 표 1 참조). 위 오가노이드 배지는 4°C에서 1주일 동안 안정적입니다.</li>
	<li>오토클레이브 겸자, 미세 해부 가위 및 1.5mL 튜브.</li>
	<li>얼음 위에서 기저막 매트릭스(Matrigel)를 해동하기 시작합니다.</li>
	<li>37°C 수조에서 분해 완충액과 Trypsin-EDTA를 해동하기 시작합니다.</li>
	<li>인큐베이터 오비탈 셰이커를 37°C 및 200rpm으로 설정합니다.</li>
</ol>2. 생검 조직에서 단일 세포 분리
<ol><li>점보 겸자의 사용이 포함될 수 있는 기관 임상 프로토콜에 따라 상부 내시경검사 17 중에 위 생검을 수집합니다. 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 겸자에서 조직 샘플을 추출하고 RPMI-ABX 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 실험실로 빠르게 이송할 수 있도록 튜브를 얼음 위에 두십시오. 알림: 최소 2-4회의 생검을 받아야 합니다.</li>
	<li>생검 조직이 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉도록 합니다. 피펫을 사용하여 배지를 흡인하고 PBS-ABX 완충액 1mL로 생검을 두 번 세척합니다. 조직 조각이 원추형 튜브에 자연적으로 침전되기 때문에 원심분리가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>최소 20mg의 생검 조직을 1mL의 PBS-DTT가 들어 있는 1.5mL 튜브에 옮깁니다.</li>
	<li>미세한 해부 가위를 사용하여 조직을 1-2mm 이하로 자릅니다.</li>
	<li>탁상용 미니 원심분리기를 15초 동안 사용하여 튜브 바닥에서 조직 조각을 응집하고 가능한 한 많은 상층액을 흡인합니다. PBS-DTT의 작은 잔류 부피가 허용됩니다.</li>
	<li>50mL 코니컬 튜브에 갓 데운 분해 완충액 5mL를 추가합니다. 조직을 잃지 않고 작은 조직 조각을 옮기려면 500μL의 분해 완충액을 조직이 들어 있는 1.5mL 튜브에 추가합니다. 다음으로, 1000 μL 피펫 팁의 팁을 가위로 수정하여 팁의 직경을 늘려 조직 조각을 쉽게 흡인하고 분해 완충액이 들어 있는 50 mL 코니컬 튜브로 옮길 수 있도록 합니다.</li>
	<li>분해 완충액과 조직 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양하고 200rpm에서 궤도를 흔듭니다.</li>
	<li>0.25% EDTA가 함유된 따뜻하게 데운 트립신 5mL를 분해 완충액에 넣고 200rpm에서 궤도 쉐이킹을 하면서 37°C에서 10분 더 배양합니다.</li>
	<li>동일한 부피의 고급(고급) DMEM/F12 배지를 추가하여 분해 완충액과 트립신을 중화하고 용액을 70μm 세포 여과기에 통과시킵니다.</li>
	<li>4°C에서 4분 동안 1400 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 생검 조직의 초기 크기에 따라 작은 세포 펠릿이 보일 수도 있고 보이지 않을 수도 있습니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 Adv. DMEM/F12 배지 1mL에 재현탁시키고 Trypan Blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.</li>
	<li>4°C에서 4분 동안 1400 x g 에서 원심분리를 통해 세포를 다시 펠트하고 상층액을 제거합니다. 참고: 그림 1 은 생검 조직에서 단일 세포를 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 것입니다.</li>
</ol>3. 기저막 매트릭스 "돔"에 단일 세포 내장
<ol><li>계수된 생존 가능한 세포 수를 기반으로 기저막 매트릭스 50μL당 105 개의 생존 가능한 세포의 최종 농도를 달성하는 데 필요한 기저막 매트릭스의 부피를 계산합니다.</li>
	<li>도금 전에 기저막 매트릭스가 중합되는 것을 방지하기 위해 다음을 신속하게 수행하십시오. 얼음에서 해동된 기저막 매트릭스를 제거하고, 이전에 계산한 기저막 매트릭스 부피를 셀에 추가하고, 약 10초 동안 피펫팅을 위아래로 하여 부드럽게 혼합합니다. 참고: 이 단계에서 거품이 생기지 않도록 하는 것이 중요합니다. 기저막 매트릭스를 희석하지 마십시오.</li>
	<li>기저막 매트릭스/세포 혼합물의 50μL 분취액을 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰 중앙으로 빠르게 피펫팅합니다.</li>
	<li>즉시 24웰 플레이트를 덮고 한 번의 부드러운 동작으로 플레이트를 거꾸로 뒤집습니다. 거꾸로 된 플레이트를 37°C 조직 배양 인큐베이터에 35분 동안 넣어 기저막 매트릭스가 중합되도록 합니다. 참고: 플레이트를 뒤집는 것은 셀이 플레이트 바닥으로 가라앉는 것을 방지하고 기저막 매트릭스가 3D "돔" 모양으로 중합될 수 있도록 하는 데 필수적입니다.</li>
	<li>500μL의 예열된 위 오가노이드 배지를 각 웰에 추가하여 각 "돔"의 상단이 배지에 완전히 잠기도록 합니다. "돔"을 방해하지 않도록 각 웰의 측면에 미디어를 분배합니다.</li>
	<li>2-3일마다 미디어를 교체하십시오.</li>
</ol>4. 단편화를 통한 오가노이드의 일상적인 패시징
<ol><li>오가노이드가 통과할 준비가 되면 지정된 각 웰에서 배지를 제거합니다. 참고: 적절한 통과 시간을 결정하려면 대표 결과 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 Adv. DMEM/F12 배지 1mL를 기저막 매트릭스 "돔"에 직접 분주합니다. 이것은 "돔"의 해체를 쉽게 시작할 것입니다. "돔"의 모든 조각이 플레이트에서 분리될 때까지 계속 흡입 및 분배합니다.</li>
	<li>매체와 조각난 기저막 매트릭스를 모두 다음 우물로 운반하고 통과 예정인 모든 우물에 대해 이 과정을 반복합니다. 최종 기저막 매트릭스 "돔"을 분해한 후 배지와 오가노이드 및 기저막 매트릭스의 혼합물을 1.5mL 튜브에 디스펜싱합니다.</li>
	<li>1000 μL 팁을 P1000 피펫에 부착한 다음 이 팁을 200 μL 팁에 삽입합니다. 이렇게 하면 오가노이드를 조각화할 수 있을 만큼 충분히 작은 직경의 피펫 팁이 생성되는 동시에 더 큰 부피를 흡인할 수 있습니다.</li>
	<li>오가노이드와 기저막 매트릭스의 혼합물을 위아래로 약 25회 세게 피펫팅하여 오가노이드를 작은 조각으로 조각화합니다.</li>
	<li>4°C에서 탁상용 원심분리기를 사용하여 2000 x g에서 30초 동안 조각난 오가노이드 혼합물을 원심분리합니다. 이로 인해 기저막 매트릭스 및 배지에서 분리된 단편화된 오가노이드 펠릿이 생성됩니다. 피펫을 사용하여 배지와 기저막 매트릭스 상층액을 흡입합니다. 펠릿이 느슨하므로 상층액을 흡입하기 위해 진공 청소기를 사용하지 마십시오.</li>
	<li>웰/돔의 수가 1:2 비율(50μL/돔)로 분할되도록 필요한 갓 해동된 기저막 매트릭스의 부피를 계산합니다. 신선한 기저막 매트릭스를 추가하고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
	<li>오가노이드 단편과 기저막 매트릭스의 혼합물 50μL를 24웰 플레이트의 개별 웰에 신속하게 분주합니다.</li>
	<li>플레이트를 덮고 거꾸로 뒤집은 다음 37°C 조직 배양 인큐베이터에 35분 동안 넣어 기저막 매트릭스가 중합되도록 합니다.</li>
	<li>예열된 위 오가노이드 배지 500μL를 각 웰에 추가합니다. 참고: 그림 2 는 단편화를 통한 위 환자 유래 오가노이드의 패시에이징에 대한 개략적인 개요를 보여줍니다.</li>
</ol>

상부 내시경 생검에서 인간 위 오가노이드 생성

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Corr&#242;, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+organoids.">A brief history of organoids.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids.">Organoids.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).</li><li>Weeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+genetic+diversity+in+organoids+cultured+from+biopsies+of+human+colorectal+cancer+metastases.">Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Lo, Y. 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P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+sensitivity+to+Wnt+signaling+gradients+in+human+gastric+organoids+derived+from+corpus+and+antrum.">Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus,+stomach,+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution.">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+reliable+image-based+AI+algorithm+for+evaluating+cellular+senescence+of+gastric+organoids.">A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids.</a> Cancer Biology &amp; Medicine. 20 (7), 519 (2023).</li><li>Skubleny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+and+Human+gastric+tissue+establishes+organoids+after+48+hours+of+cold+ischemia+time+during+shipment.">Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment.</a> Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).</li></ol>

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여기에서, 위체 및 antrum의 양성 상피의 생검으로부터 분리된 단일 세포로부터 인간 위 오가노이드를 신뢰성 있게 생성하기 위한 상세한 프로토콜이 개략적으로 설명된다. 프로토콜의 중요한 단계는 타이밍과 기저 멤브레인 매트릭스 처리와 관련이 있습니다. 생존력을 보존하려면 생검 조직을 획득한 후 가능한 한 빨리 프로토콜을 시작하는 것이 중요합니다. 목표는 생검 후 30분 이내에 생검 조?...

오가노이드는 1,2에서 파생된 장기의 구조와 기능을 닮은 소형 3차원(3D) 세포 구조입니다. 이러한 실험실 성장 모델은 줄기 세포 또는 조직 특이적 세포를 통제된 환경에서 배양하여 생성되며, 이를 통해 세포가 다양한 세포 유형으로 자체 조직화되고 분화할 수 있습니다 1,2,3. 오가노이드의 주요 장점 중 하나는 기존의 2차원(2D) 세포 배양보다 인간 생물학을 더 면밀히 재현할 수 있다는 것입니다 1,2,3. 특히, 인간 오가노이드는 기원 조직의 유전적 다양성을 유지하는 것으로 나타났습니다 3,4,5. 오가노이드는 통제된 실험실 환경에서 인간 장기 발달을 연구하고, 질병을 모델링하고, 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. 또한 오가노이드는 개별 환자 샘플에서 파생될 수 있으므로 맞춤형 의학 접근법과 개별화된 치료법의 잠재적 개발이 가능합니다 3,6,7.
연구원들은 인간 위 오가노이드를 사용하여 위 생물학 및 병리학의 다양한 측면을 조사했습니다. 대표적인 예로는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 사용하여 위암 화학요법 반응을 예측하고8,9,10 헬 리코박터 파일로리 감염에 대한 상피 반응을 모델링하는 것을 들 수 있다 11,12,13. 인간 위 오가노이드는 목 세포, 구덩이 세포 및 기타 지원 세포를 포함하여 위에서 발견되는 다양한 세포 유형으로 구성됩니다11,14. 위 오가노이드는 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 생검을 통해 얻은 위 조직으로부터 직접 분리된 줄기세포나 위 절제술 표본으로부터 생성될 수 있다11,14. 위 조직으로부터 위 줄기 세포를 분리하는 것은 일반적으로 위선을 분리 및 배양하거나 단일 세포를 방출하기 위해 조직 샘플을 효소로 소화함으로써 수행된다 9,13,15. 중요한 것은 이러한 기술 중 하나를 사용하여 생성된 위 오가노이드 내 세포의 분화가 유사한 것으로 나타났다는 것입니다13. 본원에 기술된 프로토콜은 단일-세포 분해에 초점을 맞춘다.
오가노이드는 전통적인 세포 배양과 전체 장기 사이의 격차를 해소하는 과학적 혁신을 나타냅니다. 이 분야의 연구가 계속 진행됨에 따라 오가노이드는 광범위한 응용 분야에서 보다 효과적인 치료법 및 치료법 개발에 기여할 준비가 되어 있습니다. 위 PDO의 활용도가 높아짐에 따라 PDO 생성에 대한 표준화된 접근 방식이 시의적절하게 필요합니다. 여기에서, 상부 내시경 동안 획득된 양성 위 생검 조직으로부터 분리된 단일 세포로부터 인간 위 PDO를 생성하기 위한 프로토콜이 설명된다. 중요하고 독특하게도, 위 PDO를 안정적으로 생성하고 후속 특성 분석을 허용하기 위해 파종에 대해 표준화된 수의 단일 세포가 결정됩니다. 이 기술을 사용하여 위체 또는 위 안반의 생검에서 생성된 오가노이드의 형성 및 성장에 대한 신뢰할 수 있는 차이를 입증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-X710</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase III</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>EMSCO/Fisher</td>
			<td>BP1725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>NC9326704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1570060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>155710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin ELISA Kit</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-80296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY4120-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3a ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY1324B-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of patient-derived gastric organoids from biopsies of benign gastric body and antral epithelium

위 환자 유래 오가노이드(PDO)는 위 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 고유한 도구를 제공합니다. 결과적으로 이러한 PDO는 다양한 연구 응용 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 표준화된 초기 세포 파종 밀도를 유지하면서 단일 세포 분해물에서 위 PDO를 생산하기 위한 공개된 접근법이 부족합니다. 이 프로토콜에서는 분리된 단일 세포에서 위 오가노이드를 시작하고 단편화를 통해 오가노이드를 통과시키는 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 초기 세포 파종 밀도에 대한 표준화된 접근 방식이 양성 생검 조직에서 일관되게 위 오가노이드를 생성하고 오가노이드 성장의 표준화된 정량화를 가능하게 한다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 증거는 위 PDO가 오가노이드가 신체의 생검에서 유래했는지 또는 위의 전방 영역에서 유래했는지에 따라 다양한 형성 및 성장 속도를 나타낸다는 새로운 관찰을 뒷받침합니다. 특히, 오가노이드 개시를 위해 전방 생검 조직을 사용하면 위체의 생검에서 생성된 오가노이드와 비교할 때 20일 동안 더 많은 수의 오가노이드가 형성되고 더 빠른 오가노이드 성장이 발생하는 것으로 나타났습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 연구자에게 위 PDO를 성공적으로 생성하고 작업하기 위한 시기적절하고 재현 가능한 방법을 제공한다.

Organoids are miniature three-dimensional (3D) cellular structures that resemble the architecture and functionality of the organs from which they were derived1,2. These lab-grown models are created by cultivating stem cells or tissue-specific cells in a controlled environment that allows these cells to self-organize and differentiate into various cell types1,2,3. One of the key advantages of organoids is their ability to recapitulate human biology more closely than traditional two-dimensional (2D) cell cultures1,2,3. In particular, human organoids have been shown to maintain the genetic diversity of their tissue of origin3,4,5. Organoids offer a unique opportunity to study human organ development, model diseases, and test potential therapeutics in a controlled laboratory setting. Furthermore, organoids can be derived from individual patient samples, enabling personalized medicine approaches and the potential development of individualized treatments3,6,7.
Researchers have used human gastric organoids to investigate various aspects of gastric biology and pathology. Prominent examples include the use of patient-derived organoids (PDOs) to predict gastric cancer chemotherapy responses8,9,10 and model the epithelial response to Helicobacter pylori infection11,12,13. Human gastric organoids consist of various cell types found in the stomach, including neck cells, pit cells, and other supporting cells11,14. Gastric organoids can either be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) or stem cells directly isolated from gastric tissue obtained via biopsies or from gastric resection specimens11,14. The isolation of gastric stem cells from gastric tissue is commonly done by isolating and culturing gastric glands or enzymatically digesting tissue samples to liberate single cells9,13,15. Importantly, the differentiation of cells within gastric organoids generated using either of these techniques has been shown to be similar13. The protocol described herein focuses on a single-cell digest.
Organoids represent a scientific innovation that bridges the gap between traditional cell culture and whole organs. As research in the field continues to progress, organoids are poised to contribute to the development of more effective treatments and therapies for a wide range of applications. Given the rising utilization of gastric PDOs, there is a timely need for a standardized approach to their generation. Here, the protocol for generating human gastric PDOs from single cells isolated from benign gastric biopsy tissue acquired during upper endoscopy is described. Importantly and uniquely, a standardized number of single cells is determined for seeding to reliably generate gastric PDOs and allow subsequent characterization. Using this technique, reliable differences in the formation and growth of organoids generated from biopsies of either the gastric body or gastric antrum are demonstrated.

저자 스포트라이트: Generation of and Comparison Between Patient-Derived Gastric Organoids from Different regions of the Stomach(위의 다양한 영역에서 환자 유래 위 오가노이드 생성 및 비교) 

양성 위체 및 안방 상피의 생검에서 환자 유래 위 오가노이드의 확립 및 특성화

Our research focuses on hereditary causes of gastric cancer. In particular, we're interested in hereditary diffuse gastric cancer due to disease-causing variants in either the CDH1 or CTNNA1 gene. We also investigate the role of BRCA1 and BRCA2 in gastric cancer risk and carcinogenesis.Organoids are increasingly being utilized in a variety of research domains and gastroenterology is no exception, so with this comes a need for standardization of these techniques to generate these organoids, in particular patient-derived gastric organoids. Our protocol offers a step-by-step method to reliably generate patient-derived gastric organoids from biopsies of both the antral and body regions of the stomach. In particular, we utilize a single-cell digest approach to allow for standardized seeding of cells in an effort to make reliable comparisons amongst organoids generated from different patients.Our findings show that compared to patient-derived gastric organoids from the body region of the stomach, those from the antral region actually grow more numerous and larger in size over the course of 20 days post initial seeding. These findings should be taken into account by researchers looking to utilize gastric organoids derived from different regions of the stomach.

후속 대표 결과는 상부 내시경 검사를 받는 5명의 다른 환자의 위와 위 안방 부위의 양성 상피에서 채취한 생검에서 도출되었습니다. 2 내지 4개의 "돔"/웰을 도금하여 위체 및 전방 생검 모두에 대해 환자당 분석하였다. 오가노이드는 5명의 환자 모두의 위체와 위 전방 생검 조직에서 성공적으로 생성되었습니다. 평균적으로 "돔"/웰당 41개의 오가노이드가 분석되었습니다. 모든 이미지는 컨포칼 현...

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위 환자 유래 오가노이드는 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있지만, 표준화된 파종 밀도를 가진 단일 세포 분해물에서 인간 위 오가노이드를 생성하기 위한 공식적인 프로토콜은 부족합니다. 이 프로토콜은 상부 내시경 검사 중에 얻은 생검 조직에서 위 오가노이드를 안정적으로 생성하는 자세한 방법을 제시합니다.

Gastric patient-derived organoids (PDOs) offer a unique tool for studying gastric biology and pathology. Consequently, these PDOs find increasing use in a ...

우리의 연구는 위암의 유전적 원인에 초점을 맞추고 있습니다. 특히, CDH1 또는 CTNNA1 유전자의 질병 유발 변이로 인한 유전성 미만성 위암에 관심이 있습니다. 또한 BRCA1과 BRCA2가 위암 위험과 발암에 미치는 영향에 대해서도 조사합니다.오가노이드는 다양한 연구 영역에서 점점 더 많이 활용되고 있으며 소화기학도 예외는 아니므로 이러한 오가노이드, 특히 환자 유래 위 오가노이드를 생성하기 위해 이러한 기술의 표준화가 필요합니다. 당사의 프로토콜은 위의 전방 및 신체 부위 생검에서 환자 유래 위 오가노이드를 안정적으로 생성하는 단계별 방법을 제공합니다. 특히, 단일 세포 분해 접근법을 활용하여 표준화된 세포 파종을 허용하여 서로 다른 환자로부터 생성된 오가노이드 간에 신뢰할 수 있는 비교를 수행합니다.연구 결과에 따르면 위 신체 부위의 환자 유래 위 오가노이드와 비교했을 때, 전방 부위의 오가노이드는 초기 파종 후 20일 동안 실제로 더 많고 크기가 커집니다. 이러한 발견은 위의 다른 영역에서 파생된 위 오가노이드를 활용하려는 연구자들이 고려해야 합니다.

establishment-characterization-patient-derived-gastric-organoids-from

Research

JoVE Journal

Biology

Establishment and Characterization of Patient-derived Gastric Organoids from Biopsies of Benign Gastric Body and Antral Epithelium

932 조회수.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. 우리의 연구는 위암의 유전적 원인에 초점을 맞추고 있습니다. 특히, CDH1 또는 CTNNA1 유전자의 질병 유발 변이로 인한 유전성 미만성 위암에 관심이 있습니다. 또한 BRCA1과 BRCA2가 위암 위험과 발암에 미치는 영향에 대해서도 조사합니다.오가노이드는 다양한 연구 영역에서 점점 더 많이 활용되고 있으며 소화기학도 예외는 아니므로 이러한 오가노이드, 특히 환자 유래 위...

비디오: 저자 스포트라이트: Generation of and Comparison Between Patient-Derived Gastric Organoids from Different regions of the Stomach(위의 다양한 영역에서 환자 유래 위 오가노이드 생성 및 비교) 