Gut differenzierte SBNET-Zellen wachsen langsam und schwer zu vermehren. Die wenigen etablierten Zelllinien sind den Forschern nicht ohne weiteres zugänglich. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir dieses 3D-Kulturprotokoll entwickelt.
Der Vorteil dieser Technik gegenüber der traditionellen Methode zur Festlegung einer SBNET-Zelllinie besteht darin, dass 3D-Kulturen gewonnen und Drogentests innerhalb von drei Wochen durchgeführt werden können. Diese Methode kann auf andere neuroendokrine Tumoren wie neuroendokrine Tumoren aus der Bauchspeicheldrüse angewendet werden. Nach Erhalt einer resektierten SBNET-Probe in fünf Millimeter würfeln und in 25 Milliliter DMEM F12 Medium in einem konischen Rohr für den Transport lagern.
Inkubieren Sie die Tumoren in Waschmedium nach ManuskriptRichtungen für 15 Minuten vorbereitet. Dann auf eine neue Schale übertragen und mit einer sterilen gebogenen Schere auf weniger als einen Millimeter zerkleinern. Übertragen Sie das hackfleischte Gewebe in ein neues 50-Milliliter-Rohr mit 25 Milliliter Waschmedium, zentrifugieren Sie die Probe dann bei 500 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellets in 10 Milliliter Waschmedium mit Kollagenase und DNase wieder auf. Lassen Sie die gehackten Tumore bei 37 Grad Celsius verdauen, wobei sie 90 Minuten lang langsam geschüttelt werden. Es ist wichtig, die Tumorproben nicht zu verdauen.
Zu viel Enzym oder längere Inkubationszeit tötet SBNET-Zellen ab. Nach der Verdauung ist die Röhre bei 500 mal g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 15 Milliliter Waschmedium wieder auf.
Legen Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb auf ein neues 50-Milliliter-Rohr und übertragen Sie 10 Milliliter des Waschpuffers durch das Sieb. Wirbeln Sie den Waschpuffer in der Röhre, um zu verhindern, dass die Zellen an den Seiten kleben. Filtern Sie dann die Zellsuspension durch das Sieb.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter Waschmedium wieder auf. Legen Sie die Röhre auf Eis und verwenden Sie fünf Mikroliter der Zellen für die Zellzählung mit einem Hämozytometer.
Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, wiederholen Sie dann die Zentrifugation, um den Überstand zu entfernen und die Zellen in flüssigem ECM mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter wieder auszusetzen. Als nächstes übertragen Sie fünf bis 20 Mikroliter SBNET Sphäroide in ECM auf eine 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius Inkubator, damit sich das flüssige ECM erstarren lässt. Fügen Sie 200 Mikroliter SBNET Kulturmedium zu jedem Brunnen enthaltensphäroide oder Kultur die Organoide in Stammzellmedien wie zuvor beschrieben.
Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die Organoide auf ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen und das Rohr mit 1, 500 mal g für eine Minute zu zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen. Waschen Sie die Kultur mit einem Milliliter PBS und Zentrifuge wieder, um den Überstand zu entfernen. Dann fixieren Sie die Organoide, indem Sie 500 Mikroliter Paraformaldehyd hinzufügen und sie für 15 Minuten inkubieren.
Waschen Sie die Kultur nach der Inkubation zweimal mit einem Milliliter PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS mit 3%BSA und 0,1%Triton X-100 hinzu, um die Kultur zu durchdringen. Inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten, dann waschen Sie die Organoide dreimal mit einem Milliliter PBS und 3%BSA.
Als nächstes inkubieren Sie die Kultur mit primären Antikörpern für eine Stunde und wiederholen Sie dann die Wähzahlen mit PBS und BSA. Mit den sekundären Antikörpern bebrüten und die Wässer wiederholen, um sicherzustellen, dass alle Überstande angesaugt und verworfen werden. Um die Sphäroide abzubilden, fügen Sie fünf Mikroliter Montagemedium mit DAPI hinzu und verwenden Sie eine P20-Pipette, um fünf Mikroliter der Sphäroide auf einen Glasschlitten zu übertragen.
Versiegeln Sie das Dia mit einem Coverslip und einem Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den 10-, 20- und 40-fachen Objektiven. Brechen Sie das ECM mechanisch mit einer P1000 Pipette und übertragen Sie es in ein steriles 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1 000 mal g bei vier Grad Celsius.
Dann entfernen Sie alle Überstand und legen Sie die Röhre auf Eis. Fügen Sie das zwei- bis vierfache Volumen des neuen ECM in das Pellet ein und mischen Sie den Inhalt des Rohres, indem Sie zehnmal nach oben und unten pfeifen und sicherstellen, dass luftblasen vermieden wird. Fünf bis 20 Mikroliter der ECM- und SBNET-Mischung auf eine neue 96-Well-Platte übertragen und das ECM festigen lassen.
Dann bedecken Sie das erstarrte ECM mit neuem SBNET Medium und legen Sie die Platte in den Inkubator. Wenn Sie SBNET Spheroide an ein anderes Labor versenden, übertragen Sie die Sphäroide mit dem neuen ECM in einen T25-Kolben, und lassen Sie das ECM festigen. Füllen Sie den Kolben mit SBNET Sphäroid Medium, schrauben Sie die Kappe fest auf, und bereiten Sie das Versandpaket.
Nach Erhalt der Sphäroidkultur entfernen Sie das Kulturmedium und wiederholen Sie die vorherigen Schritte, um die Sphäroide wieder in die Kultur zu versetzen. Die Wachstumsrate des SBNET-Sphäroids wurde mit mikroskopischer Bildgebung überwacht. Es dauert etwa 14 Tage, bis sich SBNET Spheroids verdoppeln, wenn die Kulturmedien einmal pro Woche gewechselt werden.
Nach 14 Tagen in der Kultur werden SBNET Sphäroide nicht größer. Die Sphäroide wurden mit Antikörpern gefärbt, die spezifisch gegen Synaptophysin, Chromogranin A und SSTR2 sind, und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie abgebildet. Die Daten zeigten, dass diese Marker im Zytoplasma und an der Membran von SBNET-Zellen lokalisiert sind.
Um die Spezifität der Antikörper zu gewährleisten, wurden die gleichen Färbungsverfahren an einer Organoidlinie aus einem Bauchspeicheldrüsentumor durchgeführt, der kein Synaptophysin, Chromogranin A und SSTR2 ausdrückt und kein grünes Signal erkannt wurde. Der Hauptvorteil der Immunfluoreszenz-Bildgebung ist, dass sie innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden kann und ähnliche Färbeinformationen wie die Immunhistochemie geben kann. SBNET als Sphäroide zu kultivieren ist eine wertvolle Technik zur Identifizierung von Medikamenten, die das SBNET-Wachstum hemmen können.
Die Sphäroide wurden mit Rapamycin und MTOR-Hemmer behandelt. Nach fünf Tagen bildete das mit Rapamycin behandelte Sphäroid eine traubenartige Struktur und wurde apoptotisch oder nekrotisch. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, das Zellsieb und das Sammelrohr mit Waschmittel vorzubefeuchten.
Dadurch wird verhindert, dass SBNET-Zellen am Zellsieb und am Kunststoffrohr kleben. Mit diesem Protokoll können Wissenschaftler und Kliniker SBNET Sphäroidkulturen aus resezierten Tumoren herstellen, sie mit anderen Laboratorien teilen und sie für die Prüfung von FDA-zugelassenen Medikamenten verwenden.
