Befestigen Sie zunächst ein zweiachsiges Goniometer mit einer Titanplatte an der Tischplatte, um die XY-Positionierung unter dem Mikroskop zu ermöglichen. Aktivieren Sie die Scan-Software, stellen Sie die Pixel auf 512 x 512 bidirektional ein, indem Sie ein 20-fach-Objektiv verwenden. Nachdem Sie die Schädelfensteroperation durchgeführt haben, platzieren Sie den Welpen, der GCaMP exprimiert, auf einer Seite der Hemisphäre auf dem Heizkissen.
Befestigen Sie die Titanstange der Kopfhalterung mit Schrauben an der Titanplatte. Stellen Sie dann den Fensterwinkel horizontal mit dem Goniometer ein. Beleuchten Sie die Gehirnoberfläche mit der Hintergrundbeleuchtung und wählen Sie den Bildgebungsbereich durch XY-Positionierung mit einer 5-fachen Objektivlinse aus.
Verabreichen Sie unter einer 20-fachen Wasserimmersionslinse Augentropfen auf das Schädelfenster. Nachdem Sie die Hintergrundbeleuchtung deaktiviert haben, scannen Sie die Gehirnoberfläche im Ein-Photonen-Modus. Erhöhen Sie die Laserintensität, um die grüne Autofluoreszenz von der Glas- und Gehirnoberfläche zu visualisieren.
Decken Sie das Mikroskop ab, um Störungen durch externes Licht zu vermeiden. Starten Sie die Scansoftware für die Bildgebung in den Zwei-Photonen-Modus. Kalibrieren Sie dann die Laserleistung und die Detektorverstärkung, um GCaMP-Signale optimal zu visualisieren.
Lokalisieren Sie die Tiefe in einem Bildgebungsbereich, der mit vielen GCaMP-exprimierenden Neuronen besiedelt ist, und starten Sie die Zeitrafferbildgebung, um GCaMP-Signale zu erfassen. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigte die Neuronenaktivitäten der vierten Schicht im Fasskortex eines postnatalen Welpen am sechsten Tag mit grüner Fluoreszenz. Das grüne GCaMP war stärker ausgeprägt, was zu einem Signalverlust in den roten Kanal und zur Identifizierung von 14 interessierenden Regionen führte.
