Initiieren Sie zunächst MATLAB und führen Sie die EZcalcium-Toolbox aus, um auf die anfängliche GUI zuzugreifen. Wählen Sie in der ersten GUI Bewegungskorrektur aus, um die GUI für die Bewegungskorrektur zu öffnen. Verwenden Sie die Option Dateien hinzufügen, um eine TIF-Datei mit den Imaging-Daten hochzuladen.
Stellen Sie als Nächstes die nicht starre Bewegungskorrektur auf blank, den Upsampling-Faktor auf 50, die maximale Verschiebung auf 15, die anfängliche Chargengröße und die Bin-Breite auf 200 ein. Klicken Sie auf Bewegungskorrektur ausführen, um die Korrektur zu starten. Aktivieren Sie in der ersten GUI die automatische ROI-Erkennung, um auf die GUI der ROI-Erkennung zuzugreifen.
Verwenden Sie die Funktion "Dateien hinzufügen", um die bewegungskorrigierten Bilddaten zu importieren. Legen Sie die Initialisierung auf gierig, die Suchmethode auf Ellipse, die Entfaltung auf eingeschränktes FOOPSI-SPGL1 und die Autoregression auf den Zerfall fest. Legen Sie dann die geschätzte Anzahl der ROIs auf 60 fest.
Weisen Sie die geschätzte ROI-Breite auf 17, den Zusammenführungsschwellenwert auf 0,95, den Fudge-Faktor auf 0,95, das räumliche und zeitliche Downsampling auf eins und die zeitlichen Iterationen auf fünf zu. Klicken Sie dann auf ROI-Erkennung ausführen, um den Erkennungsprozess zu starten. Wählen Sie in der anfänglichen GUI ROI-Verfeinerung aus, um die GUI für die ROI-Verfeinerung zu starten.
Verwenden Sie die Schaltfläche Niedrige Daten, um ROI-Daten zu importieren. Wählen Sie die ROIs mit geringer Aktivitätsfrequenz aus, die sich unter dem Schädel befinden, oder solche, die sich mit anderen Neuronen/Neuriten überlappen. Klicken Sie auf ROI ausschließen, um diese ROIs von der nachfolgenden Analyse auszuschließen.
Berechnen Sie die Delta-F x F-Werte mit dieser Gleichung. Wählen Sie XLSX als Datenexportformat und führen Sie export data aus, um eine Excel-Datei zu generieren, die mit den rohen Delta-Werten F x F gefüllt ist. Berechnen Sie den Pearson-Korrelationskoeffizienten für die Delta-F x F-Werte unter den ROIs, und erstellen Sie eine Matrix der Korrelationskoeffizienten.
Verwenden Sie die Fiji-Software, um die Zylindergrenzen aus dem TCA-RFP-Bild abzugrenzen. Ordnen Sie dann die ROIs den entsprechenden Fässern oder Septen zu. Vergleichen Sie die paarweisen Korrelationskoeffizienten innerhalb identischer Fässer und unterschiedlicher Fässer.
Generieren Sie 1.000 bis 10.000 Surrogat-Datensätze, indem Sie die Assoziation zwischen ROI-Positionen und Kalziumionenspuren nach dem Zufallsprinzip permutieren. Berechnen Sie in jedem Surrogat-Datensatz den mittleren Korrelationskoeffizienten innerhalb von Fässern einzeln und bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Korrelation. Höhere paarweise Korrelationskoeffizienten wurden innerhalb der gleichen sensorischen Verarbeitungseinheiten beobachtet als in verschiedenen Einheiten.
Die Aktivitäten zeigten trotz größerer Entfernungen eine stärkere Synchronität innerhalb der gleichen Einheiten und übertrafen damit die Korrelation mit physisch näheren Neuronen aus verschiedenen Einheiten. Der Durchschnitt der Korrelationskoeffizienten innerhalb derselben Fässer war signifikant höher als der aus 10.000 Surrogatdatensätzen berechnete. Die Korrelation innerhalb derselben Barrels war in drei verschiedenen Zeitfenstern signifikant stark.
