Bauen Sie zunächst ein Präpariermikroskop, zwei Pinzetten mit feinen Spitzen, eine Schere, eine Ein-Milliliter-Spritzennadel und Filterpapier auf einer Arbeitsplattform zusammen. Als nächstes entkernen Sie mit einer Ellenbogenschere die Augen einer betäubten Maus. Legen Sie die Augen in eine Glasschale, die 4 % Paraformaldehyd und 0,2 % Pikrinsäure in 0,1 molaren Phosphatpuffer enthält.
Stanzen Sie am Präpariermikroskop mit einer Ein-Milliliter-Spritze ein Loch in den Hornhautlimbus und schneiden Sie den vorderen Abschnitt mit einer Schere ab. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Linse von der inneren Netzhautoberfläche zu entfernen. Schälen Sie nun mit zwei Pinzetten vorsichtig die Sklera, bis die Netzhaut vollständig von der Augenmuschel isoliert ist.
Schneide anschließend die Netzhaut in vier Stücke. Waschen Sie das Netzhautgewebe nach der Fixierung über Nacht und 4%iger Paraformaldehydlösung sechsmal für jeweils 10 Minuten in 0,01 molaren PBS. Inkubieren Sie das Netzhautgewebe 30 Minuten lang in 1%Natriumborhydrid in 0,01 molaren PBS.
Auch hier sollten die Netzhautschnitte in 0,01 molaren PBS mindestens sechsmal gewaschen werden. Entfernen Sie dann den Glaskörper mit Filterpapier. Und schneiden Sie die Netzhaut mit einer zweischneidigen Rasierklinge in kleine Abschnitte zwischen 100 und 300 Mikrometern.
Waschen Sie die Netzhautstreifen in 0,01 molaren PBS sechsmal für jeweils 10 Minuten, bevor Sie sie zwei Tage lang mit Reagenz A und Reagenz B aus dem ABC-Kit inkubieren. Waschen Sie anschließend die Netzhautstreifen dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,05 molaren Tris-Puffer. Inkubieren Sie die Netzhautstreifen mit 5 % Reagenz 1 und 5 % Reagenz 3 aus dem Diaminobenzen- oder DAB-Kit in destilliertem Wasser für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Um die Netzhautstreifen mit DAB zu färben, fügen Sie nacheinander die gleiche Menge Lösung aus drei Röhrchen des DAB-Kits hinzu. Beobachten Sie unter dem Präpariermikroskop den Färbezustand. Waschen Sie die Netzhautstreifen dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,05 molaren Tris-Puffer.
Zum Schluss waschen Sie die Streifen in 0,01 molaren PBS sechsmal für jeweils 10 Minuten. In Kontrollexperimenten zeigten Zapfenstiele mit zwei Bändern und sphärische Stäbchen mit einem Band keine Immunreaktivität in Abwesenheit von primären Antikörpern. Die Proteinkinase C alpha identifizierte bipolare Stäbchenzellen in der Netzhaut.
Der DAB-Stand zeigt das Vorhandensein von Proteinkinase C, alpha und bipolaren Zelldendriten, die Synapsen mit Stäbchen- und Zapfenenden in der äußeren plexiformen Schicht bilden. Darüber hinaus hilft das DAB-Reaktionsprodukt bei der Identifizierung von bipolaren Stäbchenterminals und axonalen Prozessen in der inneren plexiformen Schicht. Es wurde gezeigt, dass Amakrinzellen mit Immunreaktivität von Substanz P präsynaptisch zu negativen Amakrinzellen von Substanz P sind.
Darüber hinaus waren Amakrinzellen der Substanz P mit Immunreaktivität postsynaptisch bis bipolaren Terminals in der Unterschicht drei bzw. der Unterschicht fünf der inneren plexiformen Schicht.
