Wir danken Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt DA023700 und DA023700-04S1 zu XX finanziert

1. Hirnschnitt Vorbereitung <ol><li> Transgene Mäuse sind tief mit Pentobarbital-Natrium (&gt; 100 mg / kg, ip) und schnell enthauptet und ihre Köpfe in einer gefrorenen und mit Sauerstoff versorgt Schneid-Lösung extrahiert. </li><li> GFP Schutzbrille verwendet werden, um visuell-Bildschirm, wenn das Gehirn der Maus in der Tat zum Ausdruck GFP. </li><li> Primären somatosensorischen kortikalen Abschnitte von 400 um dick sind mit einem Vibratom in Saccharose-haltige künstliche Liquor (ACSF) geschnitten. Slices werden zuerst in inkubiert Saccharose-haltige ACSF für 30 min bis 1 h bei 32 ° C, und nach der anfänglichen Inkubationszeit, übertragen, um die Aufnahme ACSF bei Raumtemperatur. Während der Inkubationszeit und der Aufnahme werden die Scheiben kontinuierlich mit 95% O 2 -5% CO 2 geleitet. </li></ol> 2. Ausstattung Start Die allgemeine Einführung des Systems ist in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Die Laser-Kühlung und Energieversorger eingeschaltet ist, immer den Laser bereit. </li><li> Alle verwendeten Hard Zusammenhang mit Photostimulation Kontrolle (einschließlich der Scan-Spiegel-System, einen optischen Modulator, einen elektronischen Verschluss und einer Photodiode Eingangsverstärker) ist eingeschaltet. </li><li> Die elektrophysiologischen Geräte (einschließlich einer Multiclamp 700B Verstärker und Mikromanipulatoren) ist eingeschaltet. Elektrophysiologischen Ableitungen, Photostimulation, und Abbildung der Scheibe Vorbereitungen sind in einem Stück Perfusionskammer auf dem motorisierten Tisch des Mikroskops montiert getan. </li><li> Die Wärmebildkamera (Retiga 2000, Q-Imaging, Austin, TX) ist eingeschaltet. Slices werden visualisiert mit dem aufrechten Mikroskop (BW51X, Olympus) mit Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) und epi-Fluoreszenz-Optik durch die Imaging-System. </li><li> Die Matlab-basierte EPHUS Software und Q-Capture-Software der Kamera sind in Betrieb genommen. Ein speziell modifizierte Version des Ephus Software (Ephus, verfügbar unter <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/</a> ) wird verwendet, um Photostimulation Protokolle kontrollieren und Photostimulation Daten. </li><li> Nachdem das System eingeschaltet ist, sollte man überprüfen, ob der Laser Photostimulation System ist in einem funktionsfähigen Zustand. Als 4x Mikroskopobjektiv für die Bereitstellung der UV-Blitze für Glutamat Uncaging verwendet wird, kann ein Stück weißes Papier unter gebracht werden, um die Laser-Scanning-Muster zu beobachten, während das System läuft. </li></ol> 3. Einrichten Scheibe Perfusion <ol><li> Ein unter Druck Perfusion System basiert auf der Aufzeichnung ACSF in die Scheibe Kammer Feed eingeschaltet. Es wird darauf geachtet, um eine konstante Füllstand von 2,0 mm über der Scheibe in der Kammer zu gewährleisten. </li><li> Ein Aliquot der Stammlösung des MNI-caged-Glutamat wird in 25 ml des zirkulierenden ACSF für eine Konzentration von 0,2 mM caged Glutamat aufgenommen. Bitte beachten Sie, dass nach 5-6 h des Experimentierens, der Badlösung und MNI-Glutamat wird aktualisiert. </li><li> Ein Hirnschnitt ist in der Aufnahme bewegt wird. Man kann laufen Imaging-System, um die Scheibe Qualitäts-Check und anatomisch suchen Sie den primären somatosensorischen Bereich. Dann wird die Scheibe ist mit einem maßgeschneiderten Saiteninstrumente Platinring verankert. Achten Sie darauf, um den Anker über die Hirnregion für Aufnahmen bestimmt gestellt. </li></ol> 4. Whole cell patch-Klemm-Aufnahme <ol><li> Glaselektroden (4-6 MOhm Widerstand) gezogen und mit einer internen Lösung mit 0,1% Biocytin für die Zell-Kennzeichnung und morphologische Identifizierung gefüllt. </li><li> Um Patch-Aufnahme werden die Zellen visualisiert am 60x Ziel. Inhibitory Zelltypen werden zunächst identifiziert und ausgewählt basierend auf Visualisierung der GFP-Expression unter einer DIC / fluoreszierende Olympus Mikroskop; Aufnahmen werden anschließend unter visueller Kontrolle durch Infrarot-DIC Videoüberwachung unterstützt durchgeführt. Bitte beachten Sie, dass ein paar Mal die Umstellung zwischen den DIC-und Fluoreszenz-Modi notwendig, um die GFP-Zelle Lage zu bestätigen, während Annäherung an die Elektrode an die Zielzelle. </li><li> Herkömmliche Patch-Clamp-Techniken angewendet werden. Die Elektrode wird mit Überdruck gefüllt, zog nahe an der Zelloberfläche zu einer spürbaren Delle auf die gezielte Zellmembran zu etablieren, und dann Unterdruck wird schnell angewandt, um eine undurchlässige bilden und brechen in während der Überwachung des Stromeinspeisung Antworten auf dem Videomonitor. </li><li> Nach Einbruch, werden die Bilder der Zelle bei 60x unter der DIC und Fluoreszenz-Modi für die Online-Überprüfung übernommen. Vor Sammlung von Photostimulation Daten sind Hyperpolarisation und depolarisierende Stromimpulse injiziert, um jede Zelle die grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften zu untersuchen. </li><li> Sobald stabile ganze Zelle Aufnahmen mit gutem Zugang Widerstand (meist &lt;20 M) erzielt werden, ist das Mikroskop-Objektiv von 60x auf 4x für die Laser Scanning Photostimulation eingeschaltet. Das Schnittbild mit 4x erworben und wird für die Führung und Registrierung Photostimulation Sites verwendet werden. </li></ol> 5. Laser scanning Photostimulation <ol><li> Die Photostimulation und Datenerfassung Parameter werden durch die Aktivierung der Konfiguration Switch-Modul von Ephus gesetzt. Normalerweise ist 1 ms Laser (20 mW) mit einem Stimulus Intervall von 1 Sekunde für Photostimulation Mapping verwendet. Daten Spuren von 1 Sekunde bei 10 kHz abgetastet erworben werden. </li><li> Die 4x Scheibe Bild wird in der Mapper-Modul von Ephus geladen. Die Lage der Zelle soma definiert ist, und Photostimulation Seiten eines 16x16-Muster (80 um x 80 um Abstand) sind rund um die Zelle Lage gesetzt, die alle kortikalen Schichten. </li><li> Die Anregung Profil der aufgezeichneten Neuron ist durch die Untersuchung der spiking Standorten in Reaktion auf Photostimulation über die derzeitige Einschränkung Modus abgebildet. Unsere benutzerfreundliche Software mit dem Online-Display-Funktionen erleichtert die Mapping-Experimente. </li><li> Lokale exzitatorischen Schaltung Verbindungen sind durch den Nachweis von exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSC) aus dem aufgenommenen Zelle abgebildet, während Laser-Scanning an verschiedenen Standorten. Die Zelle wird bei -70 mV in Voltage-Clamp-Modus statt, um nach innen erregenden Ströme zu erkennen. Die EPSC Karten sind 2-3 mal mit dem Photostimulation Muster gedreht wiederholt oder gekippt werden. </li><li> Optional: Local hemmende Schaltung Verbindungen können auch durch den Nachweis der inhibitorischen postsynaptischen Ströme (IPSC) aus dem aufgenommenen Zelle bei nahe 0 mV in Voltage-Clamp-Modus statt, um nach außen hemmenden Strömungen erkennen abgebildet. Beachten Sie, dass es am besten ist, die Elektrode interne Lösung mit Kalium mit Cäsium für IPSC-Mapping ersetzt sind. </li><li> Nachdem alle physiologischen Tests abgeschlossen sind, wird die Elektrode vorsichtig aus dem aufgenommenen Zelle entfernt. Die Hirnschnitt wird und in 4% Paraformaldehyd genommen festen Nacht. Die aufgenommenen Zellen wird gegen Biocytin gefärbt. Zellmorphologie mit konfokalen oder epi-Fluoreszenz-Mikroskopie, die auch bestätigt, dass jedes aufgezeichnete Zelle in der Tat ist die GFP-exprimierenden Interneuron ursprünglich angestrebten untersucht. </li></ol> 6. Photostimulation Datenanalyse Unsere neu entwickelten Methoden und Software-Implementierung 11 ist die Detektion und Messung von Photostimulation-evozierte synaptische Ereignisse in den Rohdaten Karten angewendet. Wie in Abbildung 2 veranschaulicht, sind farblich gekennzeichnet Karten gebaut, um das Muster der synaptischen Input, um die aufgezeichneten Neuronen zu illustrieren. 7. Repräsentative Ergebnisse: Beispiel Ergebnisse der elektrophysiologischen Aufzeichnung und Photostimulation Mapping sind in Abbildung 2 dargestellt. Gezielte Aufnahmen von spezifischen inhibitorischen Zelltypen werden durch Verwendung von transgenen Mäusen, die GFP in bekannten inhibitorischen Zelltypen. Angesichts der Vielfalt der inhibitorischen Interneurone, sind Analysen der GFP-Expression, intrinsische Elektrophysiologie und morphologischen Eigenschaften (Abbildung 2A) kombiniert, um die endgültige Zelltyp Einstufung zu gelangen. 2B-C zeigen, dass Laser-Scanning-Photostimulation für umfangreiche Kartierung der lokalen kortikalen leitungsvermittelte Verbindungen bis einzigen hemmenden Neuronen ermöglicht. Die Rohdaten Karte ist in Abbildung 2C dargestellt. Der direkte Uncaging Antworten sind aus der Datenanalyse (Abbildung 2C) ausgeschlossen. Die quantitative Input-Karten sind farblich gekennzeichnet, wie in Abbildung 2D-F. Das Beispiel schnell spiking inhibitorischen Interneuronen erhalten starken exzitatorischen synaptischen Inputs (EPSCs) von Layer 4 und tieferen Schichten. Durch den Bezug der Zelle synaptischen Input-Organisation definiert kortikalen Bahnen, sind wir in der Lage, seine mögliche Rolle (zB Feedback-und Feedforward-Hemmung) in kortikalen Informationsverarbeitung zu schließen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine System Instrumentierung für die Laser Scanning Photostimulation. Unser Gesamtsystem besteht aus Photostimulation Kontrolle, Video-Bildgebung und Elektrophysiologie Aufzeichnungssysteme. Wir verabschiedeten die Gestaltung der LSPS System zuvor beschrieben 7,17. Ein Laser-Einheit wird verwendet, um 355 nm UV-Laser für Glutamat Uncaging generieren. Der Laserstrahl wird durch den optischen Pfad unseres Systems gerichtet. Kurze Laufzeiten von Laserblitzen (zB 1 bis 3 ms) sind mit einer elektro-optischen Modulator (dh Pockels-Zelle) und einen mechanischen Verschluss gesteuert. Laserleistung moduliert wird durch eine neutrale Dichtegradienten Rad und durch die Umleitung ein kleiner Teil des Laserstrahls mit einem Deckglas auf eine Photodiode überwacht. Die Laser-Scanning-System beinhaltet ein XY-Paar von Scan-Spiegel, die Scan-Objektiv, das Rohr Linse und das Objektiv. Die Spiegel sorgen für den Laserstrahl durch einen Scan-Objektiv, dann der Strahl in das Mikroskop über einen dichroitischen Spiegel und wird durch eine maßgeschneiderte UV-Senderöhre fokussiert. Der Strahl Underfills der Rückseite Apertur des Mikroskop-Objektivs um eine säulenförmige (im Gegensatz zu konischen Gegensatz) Beleuchtungsstrahlengang, Haltung die Zuordnung als zweidimensionale wie möglich durch die Reduzierung der axialen Auflösung. Unter dem 4x Ziel bildet den Laserstrahl Uncaging Flecken, jeder approximating einer Gauß-Profil mit einer Breite von 153 um seitlich in der Brennebene (siehe Beilage). Verschiedene Laser-Stimulation Positionen können durch Galvanometer-driven XY Scanspiegel erreicht werden, wie der Spiegel und der Rückseite Apertur des Objektivs in konjugierten Ebenen sind, die Übersetzung Spiegel-Positionen in verschiedene Scan-Standorte auf das Objektiv Brennebene. Während Uncaging, eine variable Anzahl von gemusterten Seiten, die das gesamte Gebiet erstreckt sich nacheinander in einem nonraster stimuliert, um nonrandom Folge zu vermeiden Wiederaufgreifen der Nähe des kürzlich angeregt Seiten. Bitte beachten Sie Xu et al. (2010) für weitere Informationen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mapping lokale exzitatorische Schaltung Verbindungen zu einem GFP-exprimierenden schnell spiking Interneuron in Schicht 4 des Maus primären sensorischen Kortex. A1 und A2 zeigen die DIC-und GFP-Fluoreszenz-Bilder von der Zielzelle unter dem 60x Objektiv im lebenden Gehirn Scheibe, während A3 zeigt der Zellmorphologie durch Biocytin Färbung in den post-Aufnahme, feste Scheibe offenbart. A4 zeigt das Feuern Muster der aufgezeichneten GFP Zelle, die charakteristisch für ein schnelles Aufstocken hemmenden Interneuron, in Reaktion auf intrasomatic aktuellen Injektionen von verschiedenen Stärken. B zeigen die Scheibe Bild mit dem 16 x16 Photostimulation Websites (*) überlagert. Der Standort der Zelle wird durch den kleinen roten Kreis gekennzeichnet. C zeigt eine Anordnung von Photostimulation-evozierte Spuren aus der Stimulation Standorten in B gezeigt, während die Zelle bei -70 mV gehalten wurde, um nach innen erregenden Ströme zu erkennen. Verschiedene Formen von Photostimulation Antworten werden von den Spuren an den Standorten von 1 und 2, die erweitert und werden separat ausgewiesen im Einsatz gezeigt. Die Spur 1 ist ein Beispiel für die direkte Reaktionen (angedeutet durch die roten Pfeile) zu Glutamat Uncaging auf dem Zellkörper und promximal Dendriten. Andere Spuren in 2 sind typische Beispiele für exzitatorischen synaptischen Inputs Antworten (blau). Direkte Antworten und synaptischer Eingänge können durch ihre Amplituden und Antwortlatenzen unterschieden werden. D, E und F sind die farbigen Karten (16x16 Seiten) des durchschnittlichen EPSC Amplitude, die EPSC Zahlen, und die erste erkannt EPSC Latenz pro Standort jeweils für die Rohdaten Karte in C. Die durchschnittliche Eingangsamplitude voneinander gezeigt Stimulation Website ist die mittlere Amplitude der EPSCs in der Analyse-Fenster, mit dem Ausgangswert spontane Antwort des Photostimulation Reaktion der gleichen Stelle abgezogen. Die Zahl der EPSCs und die Ankunftszeit oder Latenz der ersten erkannt EPSC pro Standort werden ebenfalls gemessen und aufgezeichnet. Bitte beachten Sie (Shi et al., 2010) für weitere Details.

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	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. 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A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex.">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li><li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex.">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li><li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation.">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Photostimulation-basierte Mapping-Techniken sind effektiv für die Analyse von kortikalen Schaltkreisen eingesetzt. Laser Scanning Photostimulation mit Ganzkeim Aufnahme kombiniert die hohe Auflösung Abbildung von laminaren Verteilungen der präsynaptischen Input-Quellen zu einzelnen Neuronen, weil die gleichzeitige Aufnahme von einem postsynaptischen Neuron mit Photostimulation von Clustern von präsynaptischen Neuronen an vielen verschiedenen Orten bietet quantitative Maßnahmen der räumlichen Verteilung der exzitat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> transgenen Mauslinien </td><td> Jackson-Labor oder aus anderen Quellen </td><td></td><td> Bitte beachten Sie Xu und Callaway (2009) </td></tr><tr><td> GFP Schutzbrille </td><td> BLS AG, Ungarn </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica Systeme </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNI geschütztes Glutamat (4-methoxy-7-nitroindolinyl-Käfig L-Glutamat) </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> Kat. Nr. 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Biocytin </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrode puller </td><td> Sutter Instrument, Novato, CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Glasröhren zur Herstellung von Elektroden </td><td></td><td> BF150-86 bis 10 </td><td></td></tr><tr><td> Multiclamp 700B Verstärker </td><td> Molecular Devices, Sunnyvale, CA </td><td> Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> digitale CCD-Kamera </td><td> Q-Imaging, Austin, TX </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Forschung Mikroskop </td><td> Olympus, Tokyo, Japan </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> UV-Laser-Einheit </td><td> DPSS-Laser, Santa Clara, CA </td><td> Modell 3501 </td><td></td></tr><tr><td> Andere Ausrüstung für Laser Scanning phostimulation </td><td></td><td></td><td> Bitte beachten Sie Xu et al. (2010) </td></tr></tbody></table> Solutions: <ul><li> Saccharose-haltige künstliche Liquor (ACSF) für Scheiben schneiden (in mM: 85 NaCl, 75 Saccharose, 2,5 KCl, 25 Glucose, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0,5 CaCl 2 und 24 NaHCO 3). </li><li> Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4 und 10 Glukose) </li><li> Electrode interne Lösung (in mM: 126 K-Gluconat, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, und 10 Phosphokreatin, pH 7,2, 300 mOsm). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

Inhibitorischen Neuronen sind entscheidend für die kortikale Funktion. Sie umfassen etwa 20% des gesamten kortikalen neuronalen Population und können weiter in verschiedene Subtypen auf ihre immunchemische, morphologischen und physiologischen Eigenschaften 1-4 basieren unterteilt werden. Obwohl frühere Untersuchungen haben viel über die inhärenten Eigenschaften der einzelnen Arten von hemmenden Neuronen zeigten, ist das Wissen über die lokalen Anschlüsse des noch relativ begrenzt 3,5,6. Da jedes einzelne Neuron die Funktion durch ihre erregenden und hemmenden synaptischen Eingang in kortikalen Schaltkreisen geprägt ist, haben wir mit Laser-Scanning-Photostimulation (LSP) auf Karte lokalen leitungsvermittelte Verbindungen bis spezifische inhibitorische Zelltypen. Im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation oder Glutamat puff Stimulation hat LSPS einzigartige Vorteile ermöglicht für umfangreiche Kartierungen und quantitative Analyse der lokalen Funktionseingänge einzeln erfasst Neuronen 3,7-9. Laser Photostimulation über Glutamat Uncaging aktiviert selektiv Neuronen perisomatically, ohne Aktivierung Axone der Passage oder distalen Dendriten, die eine sub-Laminar-Mapping-Auflösung sorgt. Die Sensitivität und Effizienz der LSPS für die Zuordnung von Eingaben aus vielen Stimulation Standorten über eine große Region sind bekannt für kortikalen Schaltkreis-Analyse geeignet. Hier stellen wir die Technik der LSPS mit whole-cell Patch-Clamp für lokale inhibitorische Schaltung Mapping kombiniert. Gezielte Aufnahmen von spezifischen inhibitorischen Zelltypen sind durch die Verwendung von transgenen Mäusen, grün fluoreszierende Proteine ​​(GFP) in geringgradige hemmende Neuronen Populationen in der Rinde 3,10, was im Einklang Abtastung der gezielten Zelltypen und eindeutige Identifizierung der Zelltypen erfasst ermöglicht erleichtert . Was LSPS Mapping, wir das System Instrumentierung skizzieren, beschreiben die Versuchsdurchführung und Datenerfassung und präsentieren Beispiele der Schaltung Mapping in Maus primären somatosensorischen Kortex. Wie in unseren Experimenten dargestellt, ist geschütztes Glutamat in einem räumlich begrenzten Bereich des Gehirns Scheibe durch UV-Laser-Photolyse aktiviert; gleichzeitige Voltage-Clamp-Aufnahmen ermöglichen die Erfassung von Photostimulation-evozierte synaptische Antworten. Karten entweder erregend oder hemmend synaptischen Input für die gezielte Neuron durch das Scannen des Laserstrahls auf Hunderte von möglichen präsynaptischen Seiten stimulieren generiert. So ermöglicht LSPS den Bau von detaillierten Karten der synaptischen Eingänge Auftreffen auf bestimmte Arten von hemmenden Neuronen durch wiederholte Experimente. Zusammengenommen bietet die Photostimulation-basierte Technik Neurowissenschaftler ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der funktionalen Organisation der lokalen kortikalen Schaltkreisen.

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Dieses Papier stellt einen Ansatz der Kombination von Laser-Scanning-Photostimulation mit Ganzkeim Aufnahmen in transgenen Mäusen, die GFP in begrenzten hemmende Neuronen Populationen. Die Technik ermöglicht die umfassende Abbildung und quantitative Analyse der lokalen synaptischen Schaltungen des spezifischen inhibitorischen kortikalen Neuronen.

Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

mapping-inhibitory-neuronal-circuits-laser-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Aufrufe.  University of California, Irvine. Dieses Papier stellt einen Ansatz der Kombination von Laser-Scanning-Photostimulation mit Ganzkeim Aufnahmen in transgenen Mäusen, die GFP in begrenzten hemmende Neuronen Populationen. Die Technik ermöglicht die umfassende Abbildung und quantitative Analyse der lokalen synaptischen Schaltungen des spezifischen inhibitorischen kortikalen Neuronen.

Serie: Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

Design, Oberflächenbehandlung, Cellular-Überzug und Kultivierung von Modular Neuronale Netze Bestehend aus Funktionell mit Inter-Schaltungen

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.