Verbesserte konfokale 3D-Bildgebung von lösungsmittelfreiem menschlichem Herzgewebe

Verwenden Sie zunächst ein Skalpell, um 4%-Paraformaldehyd-fixiertes menschliches Herzgewebe so zu präparieren, dass es in die Kammer für die konfokale Mikroskopie passt. Dehydrieren Sie die Herzproben in einer abgestuften Methanolserie jeweils eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren, gefolgt von einem Eintauchen über Nacht in eine 66%ige Dichlormethan- und 33%ige Methanollösung unter Rühren. Bleichen Sie die Probe am nächsten Tag, indem Sie die angegebenen Schritte ausführen.

Anschließend wird die Probe mit einer abgestuften Methanolreihe jeweils eine Stunde lang unter Rühren rehydriert. Führen Sie nach der Immunmarkierung die folgenden Schritte durch, um das Gewebe für die Bildgebung vorzubereiten. Befestigen Sie eine Kammer mit Klebstoff auf einem Objektträger und tragen Sie Nagellack um den Umfang der Kammer auf.

Schalten Sie das aufrechte konfokale Laserscanning-Mikroskop ein, das mit einem 5-fach-Objektiv ausgestattet ist. Unter Verwendung von Laserlinien, die für die Emissionsspektren der verwendeten Fluorophore geeignet sind, werden Tile-Scan- und Z-Stack-Bilder mit einer Auflösung von 1024 x 1024 aufgenommen. Auf der Mikroskala ermöglicht die Gewebereinigung von Herzproben die Visualisierung von Ganglien, die Herzneuronen enthalten, und die neuronale Musterung der Myokardinnervation.