Die endogene Herzregeneration ist ein dynamischer Prozess, bei dem mehrere Zelltypen gemeinsam zusammenarbeiten, um eine robuste regenerative Reaktion zu ermöglichen. Ein Blick in das regenerierende Gewebe mittels 3D-Bildgebung des gelöschten Herzens als Reaktion auf Verletzungen kann bei der Rekonstruktion der zellulären Dynamik helfen, die diese kardiale regenerative Reaktion leiten. Unser Protokoll wurde speziell entwickelt, um Zellen während der Entwicklung und Regeneration zu verfolgen.
Wir sehen keine Einschränkungen bei der allgemeinen Anwendung unserer Räum-, Färbe- und Bildgebungstechniken auf andere Organtypen vor. Für LAD-induzierte koronare Arterienverschluss, sterilisieren Sie zuerst den chirurgischen Bereich eines anästhesierten eintägigen neonatalen Welpen mit antiseptischer Lösung. Machen Sie einen queren Hautschnitt im Brustbereich.
Um die Haut vom Muskel zu trennen, verwenden Sie ein Paar Anziehzange, um die Haut vorsichtig zu heben, während Sie die Schere vorsichtig gegen die Interkostalmuskulatur in einer geschlossenen Position drücken. Suchen Sie den vierten interkostalen Raum und verwenden Sie kleine Zangen, um eine kleine oberflächliche Punktion zu machen, die darauf achtet, die inneren Organe zu vermeiden. Mit stumpfer Sezierung und den Ankleidezangen, erweitern Sie den Bereich zwischen den interkostalen Muskeln, bis ein Finger auf die linke Seite des Bauches aufgetragen werden kann, während sie den interkostalen Raum mit Ankleidezangen offen halten, um das Herz sanft aus der Brusthöhle zu führen.
Sobald das Herz extrahiert wurde, lassen Sie das Herz auf den interkostalen Muskeln ruhen und lokalisieren Sie die LAD als die Region des Herzens mit weniger gepoolten Blut. Um einen Myokardinfarkt auszulösen, verwenden Sie eine 6-0 Naht, um einen quadratischen Knoten zweimal fest um das Gefäß zu binden, ohne die Arterie zu trennen. Das Blancnieren an der Spitze sollte sofort beobachtet werden.
Es ist wichtig, bei der Nahtplatzierung entlang des LAD für eine ähnliche Infarktgröße konsistent zu bleiben. Dies wird am besten durch den schnellen Zugriff auf das Herz erreicht, während das Blut noch durch die Arterien fließt. Wenn die Naht platziert wurde, lassen Sie das Herz wieder in die Brusthöhle rutschen.
Befestigen Sie die Rippen zusammen mit einem Chirurgen und einem quadratischen Knoten mit stumpfer Zange, um den oberen Satz von Rippen zu heben, während Sie eine 6-0 Naht durch den oberen und unteren Satz von Rippen passieren. Tragen Sie ein kleines Volumen von Hautkleber auf den Oberbauch auf und verwenden Sie feine Zangen, um die Haut des Unterbauchs über dem exponierten Brustbereich zu positionieren. Dann legen Sie den Welpen auf ein Heizkissen und führen Sie die Ligation auf das nächste Tier.
Wenn alle Operationen durchgeführt wurden, kehren Sie die warmen und mobilen Welpen in den Hauskäfig der Mutter zurück. Für passive Klarheit des geernteten Herzgewebes, 21 Tage nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, legen Sie die Maus auf einen sauberen chirurgischen Bereich in der Supine-Position und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Mit Tissue-Zangen, greifen Sie das Fell direkt unter dem xiphoiden Prozess und machen einen Schnitt über die Breite des Brustkorbs.
Schneiden Sie neben den distalen Teilen des Brustkorbs und verwenden Sie die Zange, um den xiphoiden Prozess zu heben, um das Zwerchfell freizulegen. Lösen Sie das Zwerchfell mit gekrümmten Zangen und ziehen Sie das Gewebe kranially, bis das schlagende Herz zugänglich ist. Verwenden Sie die gekrümmten Zangen, um das Herz an der Basis zu greifen und verwenden Sie Iridectomie Schere, um die Aorta und überlegene Vena cava zu schneiden.
Legen Sie das schlagende Herz in eine Petrischale aus PBS, so dass das Herz jedes zurückgehaltene Blut auspumpt. Der Myokardinfarkt kann durch eine korrekte anatomische Platzierung der LAD-Ligation bestätigt werden. Wenn das Herz aufhört zu schlagen, drücken Sie das Organ vorsichtig mit Zangen, um das Restblut zu vertreiben und übertragen Sie die Probe in eine Einweg-Glasschale Mitglas-Flasche mit zwei MilliliterPBS.
Legen Sie die Durchstechflasche mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Shaker und wechseln Sie die PBS-Lösung alle 10 Minuten, bis die Lösung blutfrei bleibt. Wenn die PBS klar ist, ersetzen Sie die PBS durch zwei Milliliter kaltes 4%Paraformaldehyd für eine vierstündige Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von drei 10-minütigen Wäschen am Shaker mit zwei Millilitern frischer PBS pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Durchstechflasche mit zwei Millilitern 4%Acrylamid füllen, ergänzt mit 0,5%VA-044 Lösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Tag die Durchstechflasche in einem 37 Grad Celsius Hitzeblock für drei Stunden platzieren. Am Ende der Polymerisation das Herz in eine neue Glasschalen-Fläschchen geben und das Herzgewebe in zwei Millilitern frischer PBS 10 Minuten gleichzeitig waschen und die PBS am Ende jeder Inkubation erfrischen. Wenn die PBS klar ist, ersetzen Sie den Waschpuffer durch zwei Milliliter Clearinglösung.
Bebrüte die Probe mehrere Wochen bei 37 Grad Celsius, bis das Herz klar ist, und erfrischen Sie die Klärlösung alle zwei bis drei Tage. Wenn das Organ klar ist, waschen Sie die Probe mit PBS auf dem Shaker, wie gezeigt, bevor Sie die Durchstechflasche mit frischem PBS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius nachfüllen. Ersetzen Sie am nächsten Tag die PBS durch RIMS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation wird das Gewebe vollständig gerodet. Das Gewebe sollte nach einigen Wochen transparent werden. Zur Abbildung des gelöschten postnatalen Mausherzes nach der Induktion des Myokardinfarkts, füllen Sie die Hälfte einer Kammer einer maßgeschneiderten Depressionsrutsche mit PBS und verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das gereinigte Herz vorsichtig in die Kammer zu übertragen.
Füllen Sie das restliche Volumen der Kammer mit PBS. Füllen Sie dann die Kammer mit PBS, bis die Oberfläche der Flüssigkeit eine Kuppel über der Oberseite der Kammer bildet und montieren Sie den Abdeckungsschlitten, bevor Sie das Gewebe durch konfokale Mikroskopie nach Standard-Bildgebungsprotokollen bebildert. Wenn die Punktion und stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen.
Wenn das Herz den Hohlraum nicht leicht verlässt, druckn Sie den linken Bauch, um den Prozess zu erleichtern. Komplikationen können auftreten, wenn das Herz auf den interkostalen Muskeln ruht. Daher ist es wichtig, die stumpfe Sezierung in einer horizontalen Ausrichtung auf eine minimale Größe zu halten, um eine klare Visualisierung und Zugänglichkeit des LAD zu ermöglichen.
Beachten Sie, dass eine oberflächliche Ligation in der letzten Nahtplatzierung weniger Anpassungsspielraum hat und dass die Nahtbindung um den LAD mit kontrollierten stetigen Bewegungen durchgeführt werden sollte. Am Ende des Clearing-Schritts sollte das ganze Herz konsequent undurchsichtig und ohne Verfärbungen in der Mitte sein. Nach ein paar Tagen in RIMS-Lösung bei Raumtemperatur sollte das Herz vollständig gelöscht werden und eine gewisse Gewebeausdehnung kann beobachtet werden.
Wie die Proteinexpression des tdTomato-Reporters beobachtet, sind die Herznerven hauptsächlich oberflächlich, wobei einige Populationen in der Epikardialschicht leben. Wichtig ist, dass die Bestätigung der Proteinexpression des Reporters nach dem gezeigten Klarheitsprotokoll erhalten bleibt. Das Clearing und die Bildgebung des 3D-Herzens bieten eine Perspektive in die Lage und Morphologie von Herzzellpopulationen.
Dies ermöglicht es uns, neue Aspekte in der Zellmusterung und Zell-Zell-Interaktionen zu identifizieren.
