Wir danken der Gruppe von Dr. Eric Olson am UT Southwestern Medical Center für die großzügige Bereitstellung der Tiermodelle. Wir schätzen alle konstruktiven Kommentare von D-Inkubator-Mitgliedern an der UT Dallas. Diese Arbeit wurde von NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) und dem UT Dallas STARS-Programm (Y.D.) unterstützt.

Lichtblattmikroskopie und Gewebereinigung für eine umfassende kardiale Bildgebung

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Die Weiterentwicklung von Bildgebungs-, Berechnungs- und Gewebereinigungsmethoden hat eine beispiellose Gelegenheit geboten, die Struktur und Funktion des Herzens umfassend zu untersuchen. Dies birgt ein großes Potenzial für die Vertiefung unseres Verständnisses der kardialen Morphogenese und Pathogenese anhand eines intakten Nagetierherzmodells. Im Gegensatz zu In-vivo-Studien an Zebrafischherzen mit einem ähnlichen Ansatz 40,41,42,43 ermöglicht uns die Integration fortschrittlicher LSM-Techniken und Geweb...

Herzinsuffizienz ist nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit, was vor allem auf die mangelnde Regenerationsfähigkeit reifer Kardiomyozytenzurückzuführen ist 1. Die komplizierte Architektur des Herzens spielt eine entscheidende Rolle für seine Funktion und gibt Einblicke in Entwicklungsprozesse. Ein tiefgreifendes Verständnis der kardialen Struktur ist unerlässlich, um die grundlegenden Prozesse der kardialen Morphogenese und des Umbaus als Reaktion auf einen Myokardinfarkt aufzuklären. Jüngste Fortschritte haben gezeigt, dass neugeborene Mäuse die Herzfunktion nach einer Verletzung wiederherstellen können, während erwachsenen Mäusen eine solche Regenerationsfähigkeit fehlt2. Dies schafft eine Grundlage für die Untersuchung von Hinweisen, die mit strukturellen und funktionellen Anomalien in Mausmodellen verbunden sind. Herkömmliche bildgebende Verfahren wie die konfokale Mikroskopie weisen technische Einschränkungen auf, darunter eine begrenzte Eindringtiefe, ein langsames Punktabtastschema und Lichtschäden durch längere Exposition gegenüber Laserlicht. Diese behindern eine umfassende dreidimensionale (3D) Darstellung des intakten Herzens. In diesem Zusammenhang erweist sich die Lichtblattmikroskopie (LSM) als leistungsstarke Lösung, die die Vorteile einer Hochgeschwindigkeitsbildgebung, reduzierter Lichtschäden und außergewöhnlicher optischer Schnittmöglichkeiten bietet 3,4,5. Die einzigartigen Eigenschaften der LSM machen sie zu einer vielversprechenden Methode, um die Grenzen konventioneller Techniken zu überwinden und beispiellose Einblicke in die kardialen Entwicklungs- und Umbauprozesse zu bieten 6,7,8.
In diesem Protokoll stellen wir eine Bildgebungsstrategie vor, die fortschrittliches LSM mit angepassten Gewebereinigungsansätzen9 kombiniert und die Bildgebung ganzer Mausherzen ermöglicht, ohne dass eine spezifische Markierung und mechanische Schnitte erforderlich sind. Wir schlagen ferner vor, dass die konventionelle LSM-Bildgebung durch Multiview-Dekonvolution10 oder axial gesweepte Lichtblattmikroskopie (ASLM) Techniken 11,12,13,14,15 verbessert werden kann, um die axiale Auflösung zu verbessern. Darüber hinaus kann die Integration von Image Stitching mit einer dieser Methoden den Kompromiss zwischen räumlicher Auflösung und Sichtfeld (FOV) effektiv überwinden und so die Bildgebung von adulten Mausherzen verbessern. Die Einbeziehung zahlreicher Gewebereinigungsansätze, einschließlich hydrophober, hydrophiler und hydrogelbasierter Methoden, ermöglicht eine tiefere Lichteindringung zur Erfassung der Morphologie des gesamten Herzens 16,17,18,19.
Während mehrere Clearing-Methoden mit aktuellen LSM-Systemen kompatibel sind, besteht das Ziel darin, die Photonenstreuung zu minimieren und die Lichtdurchdringung in Geweben wie dem Herzen zu verbessern, indem Lipide durch ein Medium ersetzt werden, das seinem Brechungsindex sehr nahe kommt. iDISCO wurde als Vertreter20,21 ausgewählt und aufgrund seiner schnellen Verarbeitung und hohen Transparenz für die Autofluoreszenzbildgebung in diesem Protokoll angepasst (Abbildung 1A). Insgesamt bietet die Integration des fortschrittlichen LSM-Ansatzes mit Gewebereinigungstechniken einen vielversprechenden Rahmen, um die komplizierte Herzanatomie in Nagetierherzen zu entschlüsseln, was ein erhebliches Potenzial für die Verbesserung unseres Verständnisses der kardialen Morphogenese und Pathogenese birgt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

Die Lichtblattmikroskopie (LSM) spielt eine entscheidende Rolle beim Verständnis der komplizierten dreidimensionalen (3D) Struktur des Herzens und liefert entscheidende Einblicke in die grundlegende Herzphysiologie und pathologische Reaktionen. Wir befassen uns mit der Entwicklung und Implementierung der LSM-Technik, um die Mikroarchitektur des Herzens in Mausmodellen aufzuklären. Die Methodik integriert ein maßgeschneidertes LSM-System mit Gewebereinigungstechniken, um die Lichtstreuung im Herzgewebe für die volumetrische Bildgebung zu verringern. Die Kombination von konventionellem LSM mit Image Stitching und Multiview-Dekonvolutionsansätzen ermöglicht die Erfassung des gesamten Herzens. Um den inhärenten Kompromiss zwischen axialer Auflösung und Sichtfeld (FOV) zu adressieren, führen wir außerdem eine axial gesweepte Lichtblattmikroskopie (ASLM) Methode ein, um unscharfes Licht zu minimieren und das Herz gleichmäßig über die Ausbreitungsrichtung zu beleuchten. In der Zwischenzeit verbessern Gewebereinigungsmethoden wie iDISCO die Lichtdurchdringung, erleichtern die Visualisierung tiefer Strukturen und gewährleisten eine umfassende Untersuchung des Myokards im gesamten Herzen. Die Kombination der vorgeschlagenen LSM- und Gewebereinigungsmethoden stellt eine vielversprechende Plattform für Forscher bei der Aufklärung kardialer Strukturen in Nagetierherzen dar, die ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

Author Spotlight: Maßgeschneiderte Light-Sheet-Bildgebung zur Untersuchung von Myokardstrukturen in Nagetierherzen

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Our research aims at customizing a light-sheet imaging system to investigate the myocardial structures of the intact rodent heart at a cellular level. We have developed a workflow to explore the intact myocardium with isotropic resolution at the micron level from neonatal to adult rodent hearts. Our study fills a gap in investigating the intricate myocardial microstructures, such as trabeculation, inside the intact ventricles, with high spatial resolution.This imaging strategy provides an entry point to assess microstructure without physical slicing, leading to an enhanced understanding of cardiac development and remodeling. We will concentrate on exploring the structural changes of the myocardium in response to cardiac injury and remodeling.

Es wurde gezeigt, dass LSM im Gegensatz zu anderen optischen Bildgebungsverfahren wie Hellfeld- und Punktscantechniken kardiale Studien fördert 31,32,33,34,35,36,37 aufgrund des minimalen Risikos von Lichtschäden, der hohen räumlichen Auflösung und der optischen Schnittbildung <sup clas...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Customized Light-Sheet Imaging for Investigating Myocardial Structures in Rodent Hearts at JoVE.com

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, ein Lichtblatt-Bildgebungssystem anzupassen, um die Myokardstrukturen des intakten Nagetierherzens auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Wir haben einen Workflow entwickelt, um das intakte Myokard mit isotroper Auflösung im Mikrometerbereich von neonatalen bis hin zu adulten Nagetierherzen zu untersuchen. Unsere Studie schließt eine Lücke bei der Untersuchung der komplizierten Myokard-Mikrostrukturen, wie z. B. der Trabekulation, in den intakten Ventrikeln mit hoher räumlicher Auflösung.Diese Bildgebungsstrategie bietet einen Einstiegspunkt zur Beurteilung der Mikrostruktur ohne physisches Slicing, was zu einem besseren Verständnis der kardialen Entwicklung und des Umbaus führt. Wir werden uns auf die Erforschung der strukturellen Veränderungen des Myokards als Reaktion auf Herzverletzungen und -umbau konzentrieren.

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

578 Aufrufe.  The University of Texas at Dallas. Unsere Forschung zielt darauf ab, ein Lichtblatt-Bildgebungssystem anzupassen, um die Myokardstrukturen des intakten Nagetierherzens auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Wir haben einen Workflow entwickelt, um das intakte Myokard mit isotroper Auflösung im Mikrometerbereich von neonatalen bis hin zu adulten Nagetierherzen zu untersuchen. Unsere Studie schließt eine Lücke bei der Untersuchung der komplizierten Myokard-Mikrostrukturen, wie z. B. der Trabekulation, in den intakten Ventrikeln...

Serie: Author Spotlight: Maßgeschneiderte Light-Sheet-Bildgebung zur Untersuchung von Myokardstrukturen in Nagetierherzen

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.