Zentrifugieren Sie zunächst das lyophilisierte Oligonukleotid-haltige Röhrchen zwei bis fünf Minuten lang bei voller Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge. Resuspendieren Sie die Oligonukleotide in TE-Puffer, um einen Hauptbestand von 100 Mikromolar herzustellen, und wirbeln Sie das Röhrchen vorsichtig vortexen. Ein Aliquot des Hauptmaterials wird mit TE-Puffer verdünnt, um einen 10-mikromolaren Stamm herzustellen und den Reaktions-Mastermix vorzubereiten.

Nachdem Sie die Mischung in die erforderlichen Röhrchen abgegeben haben, glühen Sie die Oligonukleotide in einem Thermocycler bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Lassen Sie das Rohr 30 Minuten bis eine Stunde lang auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie dann Nukleotid-Cofaktoren und andere wärmeempfindliche Pufferkomponenten zum Mastermix hinzu.

Lagern Sie die Mischung bei Bedarf bei 20 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Kombinieren Sie 22,5 Mikroliter des Substrat-Mastermixes mit 2,5 Mikrolitern der DNA-Ligase in einem PCR-Röhrchen. Legen Sie die Reaktionsgefäße sofort für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius in eine PCR-Maschine.

Um die Reaktion zu löschen, fügen Sie fünf Mikroliter Ladefarbstoff hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.