Per iniziare, centrifugare la provetta liofilizzata contenente oligonucleotidi alla massima velocità in una centrifuga da banco per due-cinque minuti. Risospendere gli oligonucleotidi nel tampone TE per preparare un master stock di 100 micromolari e agitare delicatamente il tubo. Diluire un'aliquota di master stock con tampone TE per preparare un stock da 10 micromolari e preparare la miscela master di reazione.
Dopo aver erogato la miscela nelle provette richieste, ricuocere gli oligonucleotidi in un termociclatore a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti o un'ora. Quindi aggiungere cofattori nucleotidici e altri componenti tampone sensibili al calore alla miscela master.
Se necessario, conservare la miscela a 20 gradi Celsius per un uso futuro. Combinare 22,5 microlitri della miscela master del substrato con 2,5 microlitri di DNA ligasi in una provetta per PCR. Posizionare immediatamente le provette di reazione in una macchina per PCR a 25 gradi Celsius per 30 minuti.
Per spegnere la reazione, aggiungere cinque microlitri di colorante di carico e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
