Nehmen Sie zunächst kultivierte HEK293T aus dem Inkubator. Saugen Sie das vorhandene Nährmedium aus jeder Vertiefung ab und fügen Sie zwei Milliliter frisches Medium pro Vertiefung hinzu. Um die Zellen mit gespaltener R-Loop-Plasmid-DNA zu transfizieren, mischen Sie die DNA und das PEI in 200 Mikrolitern DMEM in einem 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Vertiefung.
Wirbeln Sie die DNA und das PEI auf Stufe acht etwa zwei Sekunden lang schnell vor, um sicherzustellen, dass sie sich gut vermischen und einen Komplex bilden. Dann schleudern Sie es kurz in einer Mini-Zentrifuge herunter. Nach der Inkubation geben Sie die Mischung auf die Oberfläche des Nährmediums in der Sechs-Well-Platte mit den Zellen.
Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für sechs Stunden. Nehmen Sie anschließend die Sechs-Well-Platte aus dem Inkubator, saugen Sie das Medium ab und waschen Sie jede Vertiefung mit zwei Millilitern DPBS. Sobald das DPBS entfernt ist, fügen Sie 350 Mikroliter 0,05 % Trypsin-EDTA-Phenolrot hinzu.
Geben Sie am Ende der Inkubation 1,7 Milliliter Medium in jede Vertiefung, um die Trypsinreaktion zu stoppen. Übertragen Sie nun die Zellen zusammen mit dem Medium in ein 50-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 300 g in einer Tischzentrifuge. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter frischem Medium.
Um die Zellen in eine mit Poly-D-Lysin beschichtete 96-Well-Platte zu säen, geben Sie das erforderliche Zellvolumen in ein 50-Milliliter-Röhrchen zusammen mit dem entsprechenden Medienvolumen. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension in jede der 96 Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
