Per iniziare, prendi il HEK293T coltivato dall'incubatrice. Aspirare i terreni di coltura esistenti da ciascun pozzetto e aggiungere due millilitri di terreno fresco per pozzetto. Per trasfettare le cellule con DNA plasmidico R-loop diviso, mescolare il DNA e il PEI in 200 microlitri di DMEM in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri per ciascun pozzetto.
Agita rapidamente il DNA e il PEI al livello otto per circa due secondi per assicurarti che si mescolino bene per formare un complesso. Quindi centrifugare brevemente in una mini centrifuga. Dopo l'incubazione, far cadere la miscela sulla superficie del terreno di coltura nella piastra a sei pozzetti contenente le cellule.
Picchiettare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente la miscela e incubarla in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sei ore. Successivamente, rimuovere la piastra a sei pozzetti dall'incubatrice, aspirare il terreno e lavare ogni pozzetto con due millilitri di DPBS. Una volta rimosso il DPBS, aggiungere 350 microlitri di rosso fenolo 0,05%tripsina-EDTA.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 1,7 millilitri di terreno in ciascun pozzetto per fermare la reazione della tripsina. A questo punto, trasferire le celle insieme al terreno in una provetta da 50 millilitri e centrifugare a 300 g per cinque minuti in una centrifuga da tavolo. Aspirare il terreno e risospendere il pellet della cella con un millilitro di materiale fresco.
Per seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti rivestita di poli-D-lisina, aggiungere il volume necessario di cellule in una provetta da 50 millilitri insieme al volume appropriato di terreno. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 100 microlitri della sospensione cellulare diluita in ciascuno dei 96 pozzetti. Incubare le cellule per 18 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
