Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von RAW aus der folgenden unterstützt: National Institutes of Health gewährt K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Finanzhilfe # 5-FY12-75; Start-up-Fonds von der University of Notre Dame College of Science und Department of Biological Sciences; und ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame von Elizabeth und Michael Gallagher im Namen der Familie Gallagher zu fördern Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Forschung an Zebrafisch-Notre-Dame für ihre herausragenden Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Schließlich danken wir den Mitgliedern unserer Forschungslabor für ihre Kommentare, Diskussionen und Erkenntnisse über diese Arbeit.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir Methoden, die die Visualisierung von Nephron Segment Komponenten im erwachsenen Zebrafisch ermöglichen beschrieben. Die Injektion von fluoreszierenden Dextran-Konjugate ermöglicht Vorzugs PCT Kennzeichnung aufgrund der Eigenschaften dieser endozytischen proximalen Tubuluszellen 30,38. Dieses Verfahren kann sehr flexibel auf die Existenz von Dextranen, die mit einer Schar von unterschiedlichen Fluoreszenz-Konjugate erhalten werden können, durchgeführt werden. Darüber hinaus ist die Verwendung von Lysin fixierbar Dextrane eine besonders bequeme Weise, PCT Segmente kennzeichnen, als sekundäre Markierungsverfahren sind nicht erforderlich. Dies ermöglicht relativ einfache Signalerfassung und ist mit vielen anderen fluoreszierenden Markern, Immunmarkierung, und die Verwendung von transgenen Reporteranschlüsse. Alkalische Phosphatase Kennzeichnung markiert auch den proximalen Tubuli, mit starken Reaktivität in der PCT und etwas schwächer Reaktivität im PST. Schließlich ist die DBA-Färbung ermöglicht die Kennzeichnung von distalen Tubuli Segmente, die eine CH anzeigenaracteristic verzweigte Morphologie. Verschiedene Lektin-Moleküle, die Zucker-bindende Proteine ​​von nicht-immunen Ursprungs sind, wurden ausgiebig genutzt, um Säugetier Nephronsegmenten 47 unterscheiden. Es ist interessant, dass DBA im Zebrafisch korreliert mit distalen Tubuli Segmente, wie es verwendet wird, um Sammelkanäle in Säuger Nieren 47 zu kennzeichnen. Zusammengenommen können diese Methoden in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um die Nierenfunktion Zusammensetzung und zu dokumentieren. Da alle diese Verfahren können in ganzen Nieren Zubereitungen verwendet werden, bieten sie Werkzeuge Nephron Struktur und Funktion im gesamten Organ zu bewerten, ohne vollständig die sich auf die Verwendung von mehr zeitaufwendig, mühsam Verfahren, zB Kryoschnittes Arbeit und Immunmarkierung. Jedoch sind die in diesem Artikel beschriebene Verfahren Flecken tragfähige Kryoschnittes. Kryoschnitt Analyse erzeugt (im Vergleich zu ganze Berg), die besser geeignet für die Immunhistochemie auf spezifische Pepti erkennen sinddes, obwohl natürlich diese Art der Analyse erfordert die Verfügbarkeit von entsprechenden primären Antikörper. Leider eine große Einschränkung in der Arbeit mit dem Zebrafisch Tiermodell bleibt die schlechte Verfügbarkeit von Antikörpern. So bleibt der Wunsch der am weitesten verbreitete, dh &quot;go-to&quot; Verfahren zur Analyse der Genexpression. WÜNSCHEN mit BCIP, NBT, und / oder INT-Substrat-Reaktionen bis violett oder rot Niederschläge zu produzieren ist nicht mit Fluoreszenzfärbung auf Gefrierschnitten kompatibel. Eine Möglichkeit wäre die Verwendung von Fluoreszenzdetektion WISH, ein Verfahren, bei Zebrafisch embryonalen Proben optimiert wurde und könnte zur Verwendung mit der erwachsenen Niere zugeschnitten werden aufzurufen. Die Beschreibung der Methoden in diesem Video-Artikel sollte für weitere Experimente mit Techniken wie Fluoreszenz WISH in Kombination mit transgenen Zebrafischlinien, in denen einzelnen Segmente werden mit einem Reporter, wie eGFP oder mCherry markierten ermöglichen. Alternativ die hier beschriebenen Methoden could in Kombination mit anderen Vitalfarbstoffe, zB andere Lektine getestet werden. So könnte eine weitere Anpassung und Erweiterung der hier beschriebenen Methoden aufgerufen werden, um die Bedürfnisse der Forscher für ganze Berg Nierenpräparate und Analyse gerecht zu werden. Als solche haben diese Methoden breite Potenzial für die Umsetzung mit dem Zebrafisch-Modell für die laufende Regeneration Studien und auch in der genetischen Krankheit Modellierung. Es besteht ein dringender Bedarf für innovative Forschung und Behandlungen für Nieren Beschwerden. Millionen von Menschen leiden an irgendeiner Form von Nierenerkrankungen pro Jahr, die von angeborenen, akute und / oder chronische Ursachen führt. Ferner ist die Prävalenz von Nierenerkrankungen weiterhin weltweit steigen, was diese Krankheiten ein globales Problem der öffentlichen Gesundheit 14,15. Behandlungen, wie Hämodialyse sind, wodurch eine externe Dialysegerät dient, Blut von Stoffwechsel eines Patienten zu befreien, wenn die Nieren nicht in der Lage, diese Aufgabe durchzuführen. Leider, Hat dieser Eingriff Einschränkungen, die laufende Behandlung für das Überleben notwendig ist. Darüber hinaus werden Patienten schließlich erfordern eine Nierentransplantation, die Jahre in Anspruch nehmen können, um zu erhalten, sobald ein Patient auf eine Warteliste gesetzt. Selbst nach Erhalt einer Nierentransplantation, leiden viele Patienten Nebenwirkungen als Folge des Verfahrens und muß diese Effekte für den Rest ihres Lebens zu kämpfen. Diese Schwierigkeiten zeigen, die schwere Notwendigkeit für die Entwicklung von neuartigen Behandlungen, um entweder zu verhindern, Nierenerkrankungen oder vielleicht ergänzen Geweberegeneration 8,16,52,53. Angesichts der offensichtlichen ethischen Einschränkungen der Verwendung von menschlichen Probanden in biomedizinischen Laboratorien sind Tiermodelle wichtig für die Untersuchung der menschlichen Krankheitsentstehung und zum Testen von neuen Therapien. Als Ergebnis ihrer anatomischen Ähnlichkeit und evolutionäre Nähe hat der Maus werden die am häufigsten verwendete Modell der menschlichen Krankheit 45. Es gibt jedoch gewisse Beschränkungen für dieses Tier, including Unfähigkeit Organentwicklung in vivo und Praktikabilität der Vollendung großen genetischen Screens zu visualisieren. Zebrafische sind eine wichtige und nützliche Modellorganismus zur Untersuchung der Organentwicklung und Modellierung der menschlichen Krankheit 45,46. In Bezug auf die menschliche Krankheit, funktionale Homologen im Zebrafisch gibt es für fast 70% aller menschlichen Gene 54,55. Neuere Arbeiten haben den Nutzen der Zebrafisch für viele Bereiche der Nierenforschung 31,37,56 hervorgehoben. Studium der Regeneration und Reparatur im Zebrafisch nach AKI legen nahe, dass Röhrchen epithelialen Regeneration und neonephrogenesis sind zwei Prozesse, die auftreten und überlappen in der gesamten Regenerationszeitverlauf 30,37. Die Verwendung von einem Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin genannt wurde als Schadens Paradigma, durch die die Ergebnisse des AKI bei erwachsenen Zebrafisch 29,30,37 studieren eingesetzt. Über einen etwa zwei Wochen nach der Verletzung von Gentamicin, der proximale Tubules regenerieren, und in der Zwischenzeit neue Nephrone bilden in der gesamten Orgel 29,30,37. Im Allgemeinen sind die Mechanismen, die Epithelregeneration regulieren weiterhin sehr umstritten. Bei einem vorgeschlagenen Mechanismus des Reparaturprozesses, da die anfängliche akute Verletzungsanlaß gefolgt von einer Ablösung von toten Zellen in das Lumen. Weiter gibt es eine Reihe von de-Differenzierung, Proliferation und Migration Ereignisse, nach denen neue Zellen zu differenzieren, repopulating den verletzten Basalmembran und Wiederherstellung der Funktion zu der verletzten Stelle. Alternativ können andere Studien haben vorgeschlagen, dass der Ersatz-Zellen von Stammzellen / Vorläuferzellen, die in Nephron Tubuli liegen kommen. Im Hinblick auf den Prozess der neonephrogenesis im Zebrafisch, haben Zellaggregaten wurde von Gentamicin Injektion 29,30 beobachtet folgende AKI. Diese Aggregate später reifen in neuen Nephrone, die in bereits bestehende Tubuli 29,30 auszuloten. Der rote Faden, der nephron epithelialen Regeneration und neonephr vereintogenesis ist ihre schiere Geheimnis Faktor: derzeit gibt es mehr Fragen exponentiell zu, wie diese regenerativen Leistungen auftreten, als es verfügbar Einsichten. Bis heute ist jedoch, mehrere spannende Beweislinien unterstützen die Vorstellung, dass die Nierenregeneration Forschung mit Zebrafisch kann in der Tat relevante Vergleichs Einblicke in die menschliche AKI, die auch haben können direkte translationale Potenzial 56-58. Chemisches Screening nach kleinen Molekülen, die die Proliferation von Nierenvorläuferzellen im Zebrafischembryo kürzlich zur Identifizierung der Histon-Deacetylase-Inhibitor Methyl-4-(phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56,57 geführt erhöhen identifizieren. Verabreichung dieser Verbindung zu Zebrafisch-Larven mit Gentamicin-induzierte AKI ergab, dass Überlebens von Larven erhöht und dass die renale tubuläre Proliferation wurde verbessert 56,58. Wenn Mäuse mit moderaten Ischämie-induzierten AKI wurden mit m4PTB behandelt, ihre Erholung beschleunigt association mit einer Reduktion sowohl tubuläre Atrophie und Zellzyklusarrest proliferierender Nierenröhrenzellen 58. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wege für die normalen Zebrafisch Nierenentwicklung und / oder die regenerative Reaktion auf AKI verantwortlich ist, wird mit 56 Säugetieren konserviert werden. So, während weitere Studien erforderlich sind, um necken neben die Mechanismen der Regeneration, nämlich um die Signalwege, die beteiligt sind, zu identifizieren und zu verstehen, ihre Wechselwirkungen der Zebrafisch-bietet ein vielversprechender Weg, um dieses wichtige Ziel in der Nephrologie Feld zu verfolgen. Werkzeuge wie die in diesem Protokoll beschrieben Nephron Zelle Etiketten stellen eine Gruppe von Assays, die verwendet werden können, Nieren Zusammensetzung und Funktionalität AKI Modelle zu evaluieren. Ferner können sie verwendet, um transgene Modelle von Nierenerkrankungen zu charakterisieren und möglicherweise Wege zur chemischen Therapeutika fördern kann Restaurierung Nephron Struktur nach Nierentransplantation Damm identifizieren bereitzustellenAlter.

Die Niere ist ein komplexes Organ, das eine Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper erfüllt. Der vorderste Funktion der Niere Stoffwechselausscheidung, und diese Aufgabe ist eng mit der Aufrechterhaltung der Homöostase Fluid verflochten. Die Niere führt diese Arbeitsplätze durch Filterung des Blutes und bilden Urin, während gleichzeitig die Regulierung des Blutdrucks, Elektrolyt-Niveau, und Säure-Basen-Gleichgewicht. Hoch spezialisierte Epithelzellen Tubuli genannt Nephronen dienen als Grundfunktionseinheit der Niere 1,2. Bei erwachsenen Wirbeltieren, sind Nephrone typischerweise in einer eng gewickelten Anordnung rund um eine zentrale Entwässerungssystem organisiert, so dass für viele Tubuli in das ziemlich kleine Orgel zu packen. Zum Beispiel kann jeder menschliche Niere über 1 Million Nephronen 3 enthalten. Andere Säugetiere wie die Maus besitzen in der Größenordnung von 8 bis 10.000 Nephrone pro Niere 4. Der Grad der Nieren Komplexität unterscheidet zwischen diesen Säugetieren und anderen vertebrates aufgrund von Variationen der Gesamtzahl Nephrons und ihre architektonische Gestaltung in der Niere. Wirbeltierarten bilden so viele wie drei aufeinander Nieren Strukturen während der Entwicklung, und jeder Form zeigt zunehmende Komplexität in Bezug auf Ausstattung und Anordnung nephron: die Vorniere, Urniere und Nachniere. Die letzte Nierenstruktur beibehalten werden dient als der adulten Niere Organ-Regel ein Mesonephros oder Metanephros 2. Jede Niere Form hat jedoch eine Nephron basierende Zusammensetzung 2. Das Nephron ist das Arbeitspferd der Niere und ist für die Blutfiltration mit Metaboliten Sekretion und Resorption verantwortlich. Nephrone sind einfache röhrenförmige Strukturen aus Epithelzellen besteht und eine segmentale Organisation, in der diskreten, hoch spezialisierten Bereichen von differenzierten Epithelien besondere Aufgaben. In der Reihenfolge der Filtrat Fluss durch das Nephron, gibt es in der Regel drei Hauptteile, die comprise jede Einheit: (1) die Nierenkörperchen, (2) ein Röhrchen mit proximalen, mittleren und distalen Segmenten, und (3) ein Sammelkanal 1. Der proximale Tubulus ist für die Resorption von gelösten organischen Stoffen, insbesondere Glucose und Aminosäuren 1 verantwortlich. Die Zwischenröhrchen (oder der Henle-Schleife) ist ein wichtiger Standort von Salz und Wasserregulierung 1. Schließlich erfolgt eine Feinabstimmung von Salz und anderen Ionen im distalen Tubulus und Sammelrohr und wird von endokrinen Systems 1 geregelt. Von dort wandert das Filtrat durch den Harnleiter und Blase letztlich Verlassen des Körpers als Abfallprodukt 1. Der Verlust der Nierenfunktion kann aus einer Vielzahl von Ursachen, die normale Aktivität Nephron verhindern stammen. Diese Ursachen können während der Nierenentwicklung, zB angeborene Defekte, die zur Fehlbildung der Nephrone 5, oder die Ursachen von verschiedenen Arten von Verletzungen führen (die sich aus sowohl genetische als auch environme auftretenNTAL Herkunft). Erworben Verletzungen werden allgemein als akute Nierenschädigung (AKI) oder chronischen Nierenversagen (CKD) kategorisiert. AKI beinhaltet einen abrupten Verlust der Nierenfunktion, die oft aus Ischämie oder Toxin Exposition 6,7 resultieren. Bei Säugetieren ist nephron epithelialen Reparatur möglich nach solchen Verletzungen 8, und viele Menschen zeigen volle Wiederherstellung der Nierenfunktion nach AKI. 70% Inzidenz Bereich 6,7 - ist jedoch auch AKI mit hoher Morbidität und Mortalität, die in einem breiten 30 berichtet wurde, verbunden. CKD dagegen mit fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion, die von Jahren anhalt Schäden, typischerweise mit 8,9 Fibrose assoziiert Ergebnisse gelten. Ferner besteht ein Wechselspiel zwischen AKI und CKD, entweder kann man eine individuelle auf die andere 10-12 prädisponieren. Zum Beispiel diejenigen, die von AKI gelitten haben, sind anfälliger für CKD und sogar zum Tod 13. Das Auftreten von Nierenerkrankungen, sowohl in den USA und weltweit, hat epide erreichtmic Proportionen und wird sich voraussichtlich steigen, da die Bevölkerung im Alter erweitert-so gibt es einen wachsenden Bedarf an regenerativen Medizin Interventionen für die Niere 14,15 identifizieren. Trotz der Erkenntnis, dass AKI Patienten erholen kann, ist es schon lange gedacht, dass die Niere ist ein Organ, ohne angeborene regenerativen Kräfte. Dieses traditionelle Ansicht wurde in den letzten Jahren 16 überarbeitet. Studien, die Nierenschäden bei Mäusen und Ratten nach AKI haben gezeigt, dass Nephron Tubuli Epithelzellen vermehren und wieder aufzubauen funktionellen Nephronen 17-20. Obwohl Säugetiere besitzen diese Fähigkeit, adaptive Nephrone regenerieren, gibt es bemerkenswerte Einschränkungen und maladaptive Reaktionen ausgelöst werden, die zu Nierenfibrose und CKD 21 führen. Zum Beispiel eine aktuelle Studie gezeigt, dass wiederholte Epithelzellen Ablation in murinen Nephrone wurde mit verminderter Regeneration und Nierenfibrose-was darauf hindeutet, Nephrone hav verbundenea begrenzt Regenerationsschwelle 22. Es gibt keine Beweise dafür, dass der erwachsene Säugetierniere bildet neue Nephrone, um verlorene oder beschädigte zu ersetzen und damit deren Zerstörung führt zu einem permanenten Defizit 8,9 Nephrons. Interessanterweise haben einige Wirbeltiere zu reagieren AKI durch Regeneration nephron Epithelien und auch die Herstellung neuer Nephrone, bezeichnet ein Verfahren, das als neonephrogenesis oder nephron Neogenese 23. Neonephrogenesis tritt in Fisch nach Toxin Exposition oder teilweise Resektion und Verletzungen Modelle haben in der Vergangenheit waren die Goldfische 24,25, Tilapia 26, Skate-27, Medaka 28, und in jüngerer Zeit, der Zebrafisch 29,30. Von diesen Zebrafisch einen lebensfähigen genetischen Forschung Modell, um die zellulären und molekularen Signalwege für Nierenregeneration verantwortlich zu entdecken. In diesem Video-Artikel zeigen wir, wie man Nephronsegmenten in erwachsenen Zebrafisch zu kennzeichnen. Kenntnisse der Nephron Anatomie, molekularen Eigenschaften,und funktionellen Eigenschaften sind wesentlich für eine erfolgreiche Zukunft Nieren Studien mit Zebrafisch. Die erwachsenen Zebrafisch ist eine Niere Mesonephros Struktur und ist von Natur aus weniger komplex in Bezug auf die Anzahl und die Organisation Nephron als der Metanephros Struktur in der Erwachsenen Säugetieren, Vögeln und Reptilien 31 gefunden. Jedoch Zebrafisch Nephron Segment Organisation analog Säugetieren und wurde zuerst in der embryonalen Nieren basierend auf Genexpressionsstudien 31-35 dokumentiert. Zebrafischembryo Nephrone enthalten lineare Röhrchen Segmente, die den proximalen Konvolut (PCT) enthalten, proximalen Tubulus gerade (PST), distalen früh (DE), und distalen Ende (DL) 31-35 (Abbildung 1). Zebrafisch Erwachsenen Nephrone besitzen ähnliche Rohrsegmente 30,31,36,37 (Abbildung 1). Die PCT kann auch von einem funktionellen Phänotyps identifiziert werden: Epithelzellen in der PCT fluoreszierend markiertes Dextran-Verbindungen (10-70 kDa groß) in der vorliegenden integrierenKreislauf, der sowohl in der embryonalen und erwachsenen Zebrafisch Niere eingesetzt worden ist, um endozytischen Aufnahme durch diesen proximalen Tubuluszellen 38-41 (Abbildung 1) zu bewerten. Ein Unterschied in Nephronsegmenten zwischen Zebrafisch und Säugetiere ist, dass Zebrafisch fehlt ein Zwischenröhrchen oder der Henle-Schleife 30-37; Seit diesem Segment Funktionen bei Säugetieren, Wasser zu sparen, und Zebrafisch sind ein Süßwasserarten ohne Dringlichkeit, ihren Urin zu konzentrieren, ist es nicht verwunderlich, dass Zebrafisch fehlt dieses Segment 32,33. Somit wird die Gesamt Nephron Zusammensetzung weitgehend zwischen dem Zebrafisch und Säugetierniere 32,33 konserviert. Diese Ähnlichkeiten haben Zebrafisch ermöglicht, eine effektive Forschungswerkzeug, um die Funktionen der Nieren exprimierten Gene während der Entwicklungs Nephrogenese 32-35,42 untersuchen und zahlreiche Nierenerkrankungen 43,44 modelliert, wodurch zusätzlich zu den wesentlichen Liste menschlicher Bedingungen sein kann untersucht mitZebrafisch 45,46. Heute ist die erwachsenen Zebrafisch Niere ist ein attraktives Modell für vergleichende Studien der Nierenregeneration aufgrund seiner genetischen Lenkbarkeit und der Ausbau der technologischen Gaumen Ressourcen zur Verfügung zu Gen-Funktion und Signalwege in dieser Art zu verhören. Mehrere Studien haben die Zebrafisch-Mesonephros verwendet werden, um die Mechanismen der Regeneration nach AKI 29,30,37 zu untersuchen. Für die weitere Verwendung der AKI-Forschungs erwachsenen Zebrafisch Niere, ist es wichtig, exquisite Methoden, um verschiedene nephron Regionen und Methoden zu kennzeichnen, um nephron Funktionalität überblicken können. Mehrere Methoden für erwachsene Niere Analysen wurden aus embryonalen Nieren Protokolle angepasst. Intraperitoneale Injektion von Fluoreszenz-markierten Dextran im erwachsenen Zebrafisch bezeichnet die PCT-Epithel in Mesonephros Nephrone über Endozytose 30, wie in Zebrafischembryonen 38-41 (Abbildung 1). Diese Methode wurde verwendet, um visualize, wenn proximalen Tubuli wieder ihre resorbierbaren Eigentum folgenden AKI, die eine Beurteilung der physiologischen Funktion wiederhergestellt 30 (Abbildung 1) ermöglicht. Ein weiteres Merkmal des Nephrons proximalen Tubulus ist, dass die Epithelzellen in diesem Bereich besitzen einen Bürsten Grenze 37, die hohe endogene alkalische Phosphatase-Aktivität zeigt. Somit ist die proximale Epithel visuell im erwachsenen Zebrafisch Niere mit einem Fluoreszenz-basierten Technik, die als ELF (Enzym-markierten Fluoreszenz) bekannt -97 47 lokalisiert werden. Hier beschreiben wir, wie man fluoreszierenden Dextran-Aufnahme-Assays 30,48 im erwachsenen Zebrafisch Niere durchzuführen, um so eine funktionelle Beurteilung des proximalen Tubulus zu erhalten und ordnen Sie die Größe und Konturen dieses Röhrchen-Segment. Als nächstes beschreiben wir Verfahren zum proximalen Tubulus Regionen des adulten Nephron mit dem Fluoreszenzmarker alkalische Phosphatase zu markieren. Drittens zeigen wir zum ersten Mal, dass die rhodAmin-markiertem Lektin Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA), die als allgemeiner Marker für die Sammelkanäle in der Säugetierniere 49 verwendet wurde, kennzeichnet den distalen Tubuli der Niere erwachsenen Zebrafisch. Als DBA sich gegenseitig aus der alkalischen Phosphatase-Färbung, diese Etiketten bieten eine Möglichkeit, im Großen und Ganzen unterscheiden gesamt proximalen gegenüber gesamt distalen Strecken des erwachsenen Zebrafisch Nephrons. Im Laufe der Umsetzung dieser fluoreszierenden Flecken sowohl ganze Berg und Kryostat histologischen Schnitten, korrelieren wir diese Etiketten mit Expressionsdomänen von gelösten Transportergene, die jedes Nephron Segment eindeutig zu identifizieren. Daher enthält dieses Protokoll auch eine Anleitung zu den veränderten Gewebeverarbeitungsverfahren für erwachsene Gewebe ganze Berg in-situ-Hybridisierung (WISH) Analyse auf der Grundlage unserer Embryo WISH Protokoll 50. Diese Verfahren können in verschiedenen Kombinationen (2), die zur morphologischen und funktionellen Eigenschaften zu dokumentieren of erwachsenen Zebrafisch Niere Nephrone. Somit können diese Protokolle Regenerationsstudien der phänotypischen Charakterisierung andere Nierenerkrankungen Modelle angewendet werden, und sogar zur Bildung von erwachsenen Niere zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Der Zebrafisch-Modell wurde als relevante System zu Nieren Entwicklung, Regeneration und Krankheit zu studieren entstanden. Sowohl die embryonalen und erwachsenen Zebrafisch Nieren von Funktionseinheiten wie Nephrone bekannt, die stark mit anderen Wirbeltieren, einschließlich Säugetieren konserviert sind zusammengesetzt. Forschung im Zebrafisch hat kürzlich gezeigt, dass zwei unterschiedliche Phänomene transpirieren nach Erwachsenen Nephrone Schaden nehmen: Erstens, es ist robust Regeneration im Rahmen der vorhandenen Nephrone, die die Epithelzellen zerstört Röhrchen ersetzt; Zweitens sind völlig neue Nephronen Nieren Vorläufern in einem als neonephrogenesis bekannt ist. Dagegen Menschen und anderen Säugern scheinen nur eine begrenzte Fähigkeit zur Nephron Epithelregeneration haben. Bis heute sind die Mechanismen für diese Phänomene Nierenregeneration verantwortlich bleiben kaum verstanden. Seit erwachsenen Zebrafisch Nieren unterziehen sowohl nephron epithelialen Regeneration und neonephrogenesis, bieten sie eine hervorragende experimentelle paraDIGM, um diese Ereignisse zu studieren. Weiterhin gibt es eine Vielzahl von genetischen und pharmakologische Werkzeuge im Zebrafischmodell, das verwendet werden kann, um die zellulären und molekularen Mechanismen, die die Nierenregeneration regulieren abzugrenzen. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Auswertung von Nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt einen Satz von Markierungstechniken, die verwendet werden können, um Nieren Zusammensetzung und Test Nephron Funktion im adulten Zebrafisch Nieren messen. Somit sind diese Verfahren weithin für die Zukunft phänotypische Charakterisierung von erwachsenen Zebrafisch Nierenschädigung Paradigmen, die umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, nephrotoxicant Belichtungssysteme oder genetische Methoden der gezielten Zelltod wie Nitroreduktase vermittelte Zell Ablation Technik. Ferner könnte diese Methoden verwendet werden, um genetische Störungen in der Erwachsenenbildung Nieren studieren und könnte auch angewendet, um Nierenstatus während chronische Krankheit Modellierung zu bewerten.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Der Zebrafisch adulten Niere ist ein ausgezeichnetes System für Nierenregeneration und Krankheit Studien. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Beurteilung der nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt mehrere Methoden, die implementiert werden, um Nephron Tubuli Zusammensetzung zu beurteilen und renale Reabsorption zu bewerten.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.7K Aufrufe.  University of Notre Dame.  Der Zebrafisch adulten Niere ist ein ausgezeichnetes System für Nierenregeneration und Krankheit Studien. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Beurteilung der nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt mehrere Methoden, die implementiert werden, um Nephron Tubuli Zusammensetzung zu beurteilen und renale Reabsorption zu bewerten. 

Serie: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Blutentnahme für Biochemische Untersuchungen an adulten Zebrafisch

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...