Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens wird die Verwendung von Cisplatin als nephrotoxisches Mittel bei erwachsenen Zebrafischen, die Analyse von Entzündungen und zelltodig im Nierengewebe erklärt. Um dies zu erreichen und erwachsene Zebrafische wird anästhetisiert und gewogen, um in eine bestimmte Dosis Cisplatin in der Peritonealhöhle zu injizieren. Nach der Überwachung der Sterblichkeit wird die Niere seziert und die Zellen für Diedurchflusszytometrie isoliert oder fixiert und seziert, um durch fluoreszierenden TUNEL-Assay analysiert zu werden.
Die folgenden Verfahren können helfen, schlüsselhafte Fragen im Nierenbereich zu beantworten, indem die nephrotoxischeWirkung von Cisplatin als Werkzeug zur Entwicklung eines akuten Nierenverletzungsmodells und erwachsener Zebrafische verwendet wird. Dieses Modell kann zur Erforschung neuer therapeutischer Ziele im Nierenschutz verwendet werden, sowie den Mechanismus der Regeneration in der Zebrafischniere aufklären. Cisplatin ist ein Chemotherapeutikum zur Behandlung einer Vielzahl von Krebs.
Jedoch, kann leicht in der Niere ansammeln, Zelltod, Entzündung, und verringern die Nierenfunktion. Die Wirkung von Cisplatin ist dosisabhängig, so dass Sie unsere Erhöhung der Dosierung abhängig von Ihren Zielen senken können. Die hier verwendeten Techniken zur Analyse von Entzündungen und Zelltod sind nicht ausschließlich für die Verbreitung des Krankheitsmodells bestimmt.
Durchflusszytometrie in Zebrafischen kann helfen, die Entzündungszustände des Tieres quantitativ aufzuklären, während wir bei TUNEL sagen, dass sie das Vorhandensein von poptosierten Zellen in den physiologischen und pathologischen Kontexten klären können. Vor Beginn des Experiments bereiten Sie die Cisplatin-Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung auf 820 Mikrogramm pro mil in 0,9% Natriumchlorid verdünnen. Als nächstes befeuchten Sie einen anderen Zebrafisch und trocknen Sie den Überschuss an Wasser auf einigen Papiertüchern ab.
Wiegen Sie die Fische, indem Sie sie auf eine Waage legen, wobei Sie das Gewicht beachten. Führen Sie die Berechnungen durch, um das genaue Zuführen des Zuführens zu kennen. Um die Dosis von 120 Mikrogramm pro Gramm Gewicht zu erreichen, verwenden Sie die nächste Formel.
Teilen Sie die Enddosis durch die Dosis der Arbeitslösung und wandeln Sie diese Zahl in Mikroliter um, indem Sie für 1000 multiplizieren, um das Volumen von 120 Mikrogramm Cisplatin zu erhalten. Dann multiplizieren Sie diese Zahl mit dem Gewicht der Fische, um das endgültige Volumen zu injizieren. Legen Sie einen Fisch auf einen nassen Schwamm, mit einer kleinen Tasse, um es zu halten.
Mit der ventralen Seite nach oben und füllen Sie eine Insulinspritze mit einem berechneten Volumen von Cisplatin. Setzen Sie die Nadel in einem flachen Winkel auf die ventrale Mittellinie und ziehen Sie die ventrale Wand sanft nach oben, um zu vermeiden, dass innere Organe durchbohrt werden. Und dann injizieren Sie die Lösung.
Legen Sie nach der Injektion einen Fisch in einen Tank, um sich von der Anästhesie zu erholen, und warten Sie auf Anzeichen der Erholung wie Schwimmen und entsprechende Bewegungen. Überwachen Sie, ob die Fische zweimal täglich für die nächsten Tage fischen. Bei dieser Dosis induziert Cisplatin in den ersten 24 Stunden etwa 30% der Sterblichkeit.
Den Fisch einwerfen und den Wasserüberschuss in einem Papiertuch trocknen. Nach dem Entfernen des Kopfes und der inneren Organe, verwenden Sie Sezieren Nadeln, um die Körperwände zu fixieren. Suchen Sie die Niere in der dorsalen Wand des Fisches, und verwenden Sie Zangen, um die Niere zu lösen.
Legen Sie die Niere in eine sechs Brunnenplatte mit einer kühlen Lösung von einem 1X PBS, 2%FBS und halten Sie auf Eis. Als nächstes nehmen Sie das Gewebe mit etwas Flüssigkeit auf und leiten es durch ein 40-Mikron-Zellsieb, und mazerieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einem Spritzenkolben. Zweimal mit einer 1X PBS, 2%FBS waschen.
Und sammeln Sie die Zellen in einem 50 mils Falkenrohr. Dann Zentrifuge für fünf Minuten bei 400 G.Vorsichtig den Überstand mit einer Pipette abholen und entsorgen. Fügen Sie 500 Mikroliter kalte 1X PBS hinzu, um die Zellen wieder aufzuhängen und sie in ein fünf-MilS-Flow-Zytometrierohr zu legen.
Halten Sie sie auf Eis. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Probe und mischen Sie sie mit 90 Mikroliter Trypanblau in einem Eppendorfer Rohr. 10 Mikroliter der Mischung in eine Neobauer-Kammer geben und Zellen im Mikroskop zählen.
Nehmen Sie die Zellen, die von einem Zytometer gelesen werden sollen, und analysieren Sie dann die Ergebnisse, in der die Grundgesamtheit Ihrer Interessen ausgewählt wird. Für dieses Verfahren, einschläfern einen Fisch und entfernen innere Organe verlassen die Niere am Körper befestigt. Dann heften Sie die Körperwände an eine Korkoberfläche und legen Sie sie schrittweise über die Fixierlösung.
Halten Sie es eine vier Grad über Nacht. Am nächsten Tag, sezieren Sie die Niere mit feinem Kraft. Versuchen Sie nicht, es zu stören.
Legen Sie es in eine kleine Petrischale oder Eppendorfrohr mit 1X PBS zum Spülen. Ändern Sie die PBS und bereiten Sie 2%Agarose, um eine Unterstützungsmatrix für die Niere zu generieren, bevor sie fest verarbeiten. Entsorgen Sie alle verbleibenden PBS und gießen Sie die Agarose langsam.
Positionieren Sie dann die Niere mit feinen Zangen, um zu verhindern, dass sie sich faltet. Agarose bei Raumtemperatur erstarren lassen. Nach der Agarose-Erstarrung, verwenden Sie ein Skalpell, um Agarose um die Nieren zu schneiden, die einen kleinen Würfel bilden.
Legen Sie die Agarose-Würfel in eine histologische Kassette und senden Sie sie zur histologischen Verarbeitung, um das Gewebe in Paraffin einzubetten. Die Paraffinblöcke, werden wir dann in fünf Mikrometer Dicke Abschnitte schneiden. De-Wachs gleitet und in destilliertem Wasser aufbewahren.
Bereiten Sie eine dunkle Inkubatorkammer vor und legen Sie nasse Papiertücher an die Unterseite. Legen Sie die Dias in die dunkle Kammer, und fügen Sie Proteinase K für die Permeabilisierung des Gewebes hinzu. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Während Proben inkubiert werden, bereiten Sie das TUNEL-Reaktionsgemisch vor, indem Sie 50 Mikroliter Enzymlösung auf 450 Mikroliter Etikettenlösung hinzufügen. Und vor Licht geschützt bleiben. Nehmen Sie die dunkle Kammer und waschen Sie die Scheibe zweimal mit einem 1X PBS.
Als nächstes trocknen Sie die Dias und auf dem TUNEL-Reaktionsgemisch. Und bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden inkubieren. Waschen Sie diese Dias nach der Inkubation erneut mit einer 1X PBS.
Und fügen Sie DAPI für Kerne Gegenfärbung. Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten, vor Licht geschützt. Spülen Sie dreimal mit einem 1X PBS.
Und dann, Formen Sie die Dias mit einem Anti-Fade hydrophilen Medium. Legen Sie einen Deckelzettel auf. Und mit Nagellack versiegeln.
Visualisieren Sie die Proben in einem Fluoreszenzmikroskop. In diesem Diagramm ist es möglich zu sehen, dass Cisplatin eine Dosis-Wirkung auf das Überleben von Fischen hat, im Vergleich zu einer Kontrolle, die nur mit 0,9% Natriumchlorid injiziert wurde. Die rote Linie in diesem Diagramm stellen eine Dosis von 120 Mikrogramm pro Gramm in diesem Video verwendet.
Diese Dosis kann auf Männer und Frauen angewendet werden, da kein statistischer Unterschied zwischen ihnen gefunden wurde. Durchflusszytometrie ermöglicht es, verschiedene Zellen in einem Gewebe zu quantifizieren. Hämatopoetische Zellpopulationen werden in der Niere mehrerer Fische durch Größe oder Vorwärtsstreuung und Granularität oder Größenstreuung identifiziert.
Auf diese Weise ist es möglich, die Populationen in Erythrozyten, Lymphozyten, Granulozyten und hämatopoetischen Vorläufern zu trennen. Hier ermöglicht die aktuelle Gate-Strategie, die Granulozyten, Singlets und MPO-positiven Zellen auszuwählen, die Population der Neutrophilen in der Niere zu finden, die durch die Fluoreszenzexpression der Myeloperoxidase gekennzeichnet ist. In diesem Fall induzierte die Injektion von Cisplatin den Anstieg des Prozentsatzes der Neutrophilen in der Niere.
Der TUNEL-Assay ermöglicht es, apoptotische Zellen in einem Gewebe zu erkennen, indem gewebedia der Niere durch ein Fluoreszenzmikroskop beobachtet wird, es ist möglich, apoptotischesignale in den Kernen einiger Zellen zu sehen, hier in Rot. Im Gegensatz zu einem nuklearen Fleck in einem solchen DAPI hier in blau. Die Cisplatin-Injektion erhöhte das Vorhandensein von apoptotischen Zellen in der Niere, die manuell oder mit einer Bildsoftware quantifiziert werden können.
Am Ende dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, zu wissen, wie man die Dosis von Cisplatin injiziert und anpasst, um akute Nierenverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen zu induzieren. Und wie man die Niere für verschiedene Zwecke seziert. Durchflusszytometrie ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, das Ihnen hilft, das Profil verschiedener Zelltypen zu verstehen, abhängig von der Verfügbarkeit von Tragenclave-Linien in Ihrem Labor.
Denken Sie daran, die Farbe der Transporterlinien zu berücksichtigen, wenn Sie Antikörper verwenden möchten, um alle ihre Zelltypen zu beschriften. Der TUNEL-Assay ist ein einfaches Werkzeug, mit dem wir apoptotische Zellen und Gewebe erkennen können und kann nicht nur durch Mikroskopie, sondern auch durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Denken Sie daran, verwenden Sie immer persönliche Schutzausrüstung während des gesamten Verfahrens.
