Name: kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury
Uploaded: 2015-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
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This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

HINWEIS: Ethics Statement: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Massachusetts General Hospital Richtlinien für Tierversuche in der Forschung durchgeführt. 1. Voraus Vorbereitung <ol><li> Ermitteln Sie, wie viele erwachsenen Zebrafisch 6-12 Monate alt, um zu verletzen. Plan, um 10-20% mehr Fische als benötigt zu verletzen. Um Schwankungen zu minimieren, abgestimmte Einsatz Alter Geschwister Fische in der gleichen Tank gemeinsam aufgezogen, so dass sie ungefähr die gleiche Größe und weniger genetische Variabilität. Weiblichen Fische sind viel einfacher zu injizieren, verglichen mit dem männlichen Fische aufgrund der größeren Kapazität des Bauches. , Männchen und Weibchen geben jedoch ähnliche Ergebnisse. </li><li> Wenn dabei den Versuch zum ersten Mal, eine Dosiskurve zu zeichnen, um die geeignete Dosierung für ein Gentamycin spezifischen Stammes von Fisch zu bestimmen. Testen jeder neuen Charge von Gentamicin vor der Verwendung in Experimenten, da die Reinheit des Gentamicin variiert von Charge zu Charge. Die richtige Dosierung sollte durch die Bewertung expressi bestimmt werdenauf Verletzungsmarker wie lhx1a. (Siehe 1A - D). </li><li> Bereiten Gentamicin-Lösung. Gentamicin-Stammlösung kann in -20 ° C gelagert und zur späteren Verwendung aufgetaut werden. Zum Beispiel für eine 80 mg / kg-Dosis (80 mg Gentamicin / kg Körpergewicht) in einem Fisch einem Gewicht von 0,5 g, herzustellen 2 mg / ml Gentamycin in phosphatgepufferter Salzlösung als eine bequeme Arbeitslösung. Dies stellt eine 20 ul Gentamycin zur intraperitonealen Injektion in den Fisch. HINWEIS: In der Regel 80 bis 120 mg / kg erzielen gute Ergebnisse, aber so geringen Dosen wie 40 mg / kg geeignet sein. Gentamicin kann auch in Lösung erworben werden, um die Exposition gegenüber gefährlichen Laborpersonal zu minimieren. HINWEIS: Gentamicin in hohen Dosen giftig sein können. Tragen Sie Handschuhe und Maske bei einem Gewicht von Pulver. </li><li> Bereiten Sie 100 ml von 0,016% Tricaine Wasser für Anästhesie Fisch. Bereiten Sie eine Bestandsaufnahme 25x Tricaine (4 g / 1 L) in sterilem Milli-Q-Wasser gelöst, auf pH 7 und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Verdünnen Sie 4 ml in 100 ml Wasser für Fisch einer Arbeitskonzentration von 0,016%. HINWEIS: Tricaine ist ein Anästhetikum und hautreizend, Handschuhe bei der Handhabung. </li><li> Machen Sie einen Fisch aus einem Kunststofftransferpipette schöpfen, indem die Lampe in Form einer Kugel und Schneid 2 Steckplätze in den Boden, das Wasser abgeleitet. Last 1 ml Spritzen (mit 10 ul Abstufungen) mit der vorbereiteten Lösung Gentamicin und fügen Sie eine 30½ G Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen. Drehen Sie die Nadel auf die Spritze, um sicherzustellen, dass die gebogene Spitze auf der Nadel abgewandten und die Spritze Markierungen nach vorne und lesbar. Für Steuereinspritzungen, bereiten eine Spritze und Nadel mit sterilem PBS. </li><li> Bereiten Sie eine Skala mit einer sauberen Oberfläche oder wiegen Boot sowie Papierhandtücher zum Trocknen von Fisch und zum Halten von Fisch für die Injektion. </li><li> Bereiten einzelnen kleinen Halbliter-Behälter mit Deckel zur Aufnahme von Fisch zur Beobachtung über Nacht nach der Injektion. Kleinen transparenten Kunststoff Führungskäfige sind für diesen Zweck nützlich. DieseBehälter nicht weiß - im Idealfall sollten sie klar sein, so dass die weißen epithelialen Abgüsse von den Fischschuppen auf einem schwarzen Tischplatte beachten. Füllen Sie jeden Container mit genug Fisch Wasser für die Fische, um bequem zu schwimmen. </li></ol> 2. intraperitoneale Injektion von Gentamicin <ol><li> Betäuben die Fische in 0,016% Tricaine Lösung in Fischwasser. Warten Sie auf den Kiemenventilationsrate zu verlangsamen und die Fische nicht mehr auf Berührung reagieren. </li><li> Schöpfen die Fische mit dem Fisch Schaufel, sich von Kopf zu Schwanz, um nicht zu verletzen, die Kiemen oder Flossen. Den Fisch auf Küchenpapier, um das überschüssige Wasser durch Drehen der Fisch aus sanft auf die Seite aufnehmen und schütteln Sie überschüssiges Wasser aus der Schaufel. </li><li> Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie in die wiegen Boot auf der Skala auf Null gestellt und wiegen die Fische. Runde auf den nächsten 0,25 g, und berechnen Sie die entsprechende Menge an Gentamicin zu injizieren. HINWEIS: Für eine 0,5 g Fisch mit einem 20 &amp; mgr; l Injektion in 80 mg / kg-Dosis. </li><li> Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie auf einer trockenen gefalteten Papiertuch. Wenn die Injektion mit der rechten Hand den Papiertuch in der linken Hand und legen Sie den Kopf des Fisches nach links, mit der Bauch leicht zugänglich. </li><li> Halten Sie die Spritze mit der Nadel in einem 45 ° Winkel auf die Haut des Bauches, anterior der Kloake. Drücken Sie die Nadel unter die Haut, dann den Winkel zu verringern, und schieben Sie die Nadel nach vorne unter die Haut, die Vermeidung der inneren Organe. Drücken Sie den Kolben der entsprechenden Menge, innehalten, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit kommt heraus um die Nadel, dann ziehen Sie die Nadel. Wenn die Fische halten stetigen ist ein Problem, Klammer Ellbogen Oberkörper, um sie zu stabilisieren. HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Gentamicin-Lösung. </li><li> Drop jeden Fisch zu einem individuellen Behälter. Beobachten Sie die Fische und deren Verwertung aus der Narkose. Halten Fisch bei 28,5 ° C über Nacht. HINWEIS: Wenn die Fische nicht sofort wieder zu beleben, mit einem Kunststoff-transfer-Pipette, um Wasser zu bewässern über die Kiemen, um es wieder zu beleben. </li><li> Verwenden Sie die gleiche Spritze und Nadel bei der Injektion mehrere Fische mit der gleichen Dosis von Gentamicin. Entsorgen Sie die Spritze und Nadel in die entsprechende Biohazard Behälter für spitze Gegenstände. </li></ol> 3. Nacheinspritzung Beobachtung der Verletzungen <ol><li> Am nächsten Tag (1 Tag nach der Verletzung), legen Sie die injizierten Fische in ihrem Behälter auf einer dunklen Oberfläche. Weiß Abgüsse von Toten Epithelgewebe von den verletzten Fisch ausgeschieden sollte sichtbar sein. (Siehe Abbildung 1 E - H). Wenn es keine Zylinder entweder der Fisch nicht durch die Gentamicin Injektion verletzt (entweder die Dosierung zu niedrig, oder einige der Gentamicin während des Spritzvorgangs ausgetretene) oder der Fisch wurde ernsthaft verletzt zu einer vollständigen Blockierung der Harnleiter und Kloake mit abgestoßen Gewebe. HINWEIS: Wenn die Fische nicht in der Lage, um die Abgüsse vom Körper es in der Regel innerhalb von 2-3 Tagen sterben, zu löschen und damit unbrauchbar für längereAssays. Wenn keine Zylinder sichtbar sind, einschläfern die Fische in Tricaine Wasser für mindestens 10 min eingetaucht, nachdem gill Bewegung stoppt. </li><li> Wenn weißes Seiden Abgüsse sichtbar sind, stellen Sie den Fisch beiseite und weiterhin die Überprüfung der anderen Fischen. Eine geeignete Dosis von Gentamicin in 80-90% der Fische wobei brauchbaren Ergebnis. Pool des verletzten Fisch und dann teilen sie in verschiedene Behandlungsgruppen, falls gewünscht. </li></ol> 4. Pflege von Einholen von Fisch <ol><li> Halten Fische in sauberes Wasser und menschenleeren Umgebung. Schmutzwasser und Gedränge wird, um Infektionen und ungewollten Tod führen. Versuchen Sie, nicht mehr als 6 Fisch / 500 ml Fisch Wasser täglich, wenn möglich zu halten und das Wasser wechseln. Anmerkung: Dies ist ein Minimalvolumen für die Konservierung der Raum oder der Prüfer wünscht Experimente mit teuren Arzneimittelbehandlungen durchzuführen. </li><li> Haben die Fische zu füttern nicht bis 3 Tage nach der Verletzung. Einholen von Fisch wird zunächst nicht zu essen, und alle Lebensmittel in den Tank zersetzt und fördern Bakterien growth. Ab 3 Tage nach der Verletzung, füttern Sie eine kleine Menge einmal täglich. </li></ol> 5. Analyse der Verletzte Nieren <ol><li> Für in-situ-Hybridisierung für lhx1a mRNA-Expression kann Nieren von Fisch in gewünschten Zeitpunkten geerntet werden. Euthanize Fisch in Tricaine Wasser auf Eis mindestens 10 min bis gill Bewegung stoppt, entfernen Sie dann den Kopf mit einer Rasierklinge und öffnen Sie die Körperhöhle und entfernen Sie die inneren Organe mit einer Pinzette. </li><li> Verlassen Sie die Niere statt (pigmentierte Orgel an der dorsalen Körperwand befestigt) und befestigen Sie den Fisch in 4% Paraformaldehyd in PBS über Nacht. Sezieren die Niere 15 und fahren Sie mit Standard-in-situ-Hybridisierung. <ol><li> Kurz gesagt, wasche die Nieren in PBST (phosphatgepufferte Salzlösung 0,5% Tween 20), mit Proteinase K in PBST (10 ug / ml) für 1 h bei Raumtemperatur permeabilisiert. Post-fix mit 4% Paraformaldehyd und mit PBST gewaschen. </li><li> Dann vorge hybridisieren die Nieren über Nacht bei 68; ° C in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5 × SSC, 50 ug / ml Heparin, 500 ug / ml tRNA, 0,1% Tween20, pH 6,0). </li><li> Die Proben mit Digoxigenin markierten Sonde in Hybridisierungspuffer inkubieren, dann für 5-10 min waschen mit je 100%, 75%, 50%, 25% Hybridisierungspuffer bei 68 ° C, dann in Raumtemperatur und zweimal Waschen für 30 min mit 2 × SSC mit 0,1% Tween 20, und waschen zweimal für 30 min mit 0,2 × SSC mit 0,1% Tween20. </li><li> Äquilibrieren die Probe 3x 5 min in MAB (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) gewaschen und über Nacht bei 4 ° C in MAB mit 10% Ziegenserum blockiert. Dann inkubieren Proben über Nacht in Anti-Digoxigenin-AP Fab 1: 5.000 in MAB. </li><li> Für 1 h in MAB wasche die Probe 5x und äquilibrieren 3x 15 min in NTMT (0,1 M Tris pH 9,5, 0,05 M MgCl 2, 0,01 M NaCl, 50 &amp; mgr; l Tween 20). </li><li> Dann behandeln die Nieren mit NBT / BCIP zu Signal zu erfassen. Befestigen Sie die Nieren mit 4% Paraformaldehyd und in Dimethylformamid inkubiert, um remove überschüssige NBT / BCIP, über Nacht in entionisiertem Wasser gebleicht. Waschen Sie die Nieren und dann in PBST fotografieren mit 50% Glycerin unter einem Deckglas. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing financial interests to disclose.

Der Zebrafisch ist ideal für das Studium der Regeneration von erwachsenen Organen, einschließlich der erwachsenen Niere Mesonephros 6. Jüngste Studien haben den Vorteil von molekularen Markern und neuen transgenen Reporter Linien besser zu charakterisieren die Schritte, die während Nephron Regeneration auftreten und welche Zellen verantwortlich 7,12 sein könnten. Beobachtung Harnzylinder ist seit über einem Jahrhundert verwendet, um Nierenerkrankungen beim Menschen 16 zu diagnostiz...

Die Niere ist für die Flüssigkeit Homöostase, Blutdruckregulation und Filtration von Abfall aus dem Körper. Obwohl Säugetiere sind in der Lage, bestehende Nephrone nach Verletzung mit differenzierten Epithelzellen 1-4 reparieren, scheinen sie einen Pool von reservierten Stammzellen 5 fehlt und sind unfähig, neue Nephrone de novo bilden. Im Gegensatz zu Säugetieren, sind erwachsene Fische können neue Nephronen während des Erwachsenenlebens zu bilden, um das Wachstum der Fische und in Reaktion auf eine Verletzung 6,7 unterstützen. Der Zebrafisch, Danio rerio, ist ein unschätzbares Modellorganismus für das Studium der Organregeneration 8-10 und hat das Potenzial, leistungsstarke Einblicke in die Anwendungen für Engineering der Reparatur von menschlichen Nieren zu schaffen. Die Tg (Lhx1a: EGFP) Transgen 11 ist gezeigt worden, um einen Pool von Nephron-Vorläuferzellen im erwachsenen Zebrafisch Nieren 12 kennzeichnen jedoch Mechanismen, die die Reaktion der lhx1a + Zellen verletzungs rEmain unklar. Das Aminoglycosid Gentamicin ist ein häufig verwendetes Antibiotikum mit bekannten nephrotoxischen und ototoxic Wirkungen bei Menschen 13. Intraperitoneale Injektion von Gentamicin ist ein etabliertes Verfahren zur Induktion der akuten Nierenschädigung in Fisch 6. Diese Verletzung in Fisch imitiert den Verlust von Tubulusepithel und Vernarbung der Glomeruli, die nach Gentamicin 14 Dosierung beim Menschen auftritt. Induzieren Schädigung im Zebrafisch Refobacin Injektion ist ein bequemer Weg induzieren eine starke, synchrone Regenerierung Reaktion mit vielen neuen Nephronen erzeugt und gleichzeitig durch die Stufen der Bildung, Proliferation und Differenzierung fortfahren. Dieses Protokoll Details unserer Verfahren für robuste und reproduzierbare Verletzung im erwachsenen Zebrafisch Niere durch die Verwendung eines nicht-invasiven bild Screening-Prozess, um Ausreißer zu minimieren. Wir nutzen die Tatsache, dass Verletzungen mit Gentamicin führt zum Tod von epithelialen Nierengewebe und FormatIon der Nierentubuli Abgüsse, die dann in Massen sammeln sich in den Mesonephros Kanäle und Kloake. Diese werden durch den Fisch geführt und kann visuell im Wasser beobachtet werden. Dies erlaubt uns, für Fische mit stark nicht-tödliche Verletzungen, die dann für weitere Experimente gebündelt werden können screenen. Minimierung der Zahl der unverletzten Fische oder Fische, die vor Erreichen der Endpunkt des Experiments führt zu mehr einheitliche und effiziente Datenerfassung und -analyse zu sterben. Darüber hinaus sind keine speziellen Geräte oder Reagenzien erforderlich, so dass diese Verfahren kostengünstiger und geeigneter für die Verwendung in einem akademischen oder Lehr Einstellung. Mit unserem Verfahren, hier zeigen wir die zunehmenden Auswirkungen von Gentamicin-Dosis auf die Nierenregeneration sowie die Wirkung der erhöhten Temperatur.

<table><tbody><tr><td>gentamicin sodium sulfate</td><td>Sigma</td><td>G1264</td><td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td></tr><tr><td>plastic transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Norm-Ject syringes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72520</td><td>green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately</td></tr><tr><td>30 G1/2 needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>IRRITANT</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Make 4% in 1x PBS for working solution</td></tr></tbody></table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Gentamicin Verletzung kann visuell durch Beobachtung der Nierenepithelzellen Abgüsse im Wasser (1) bestätigt werden. Verschiedene Dosierungen von Gentamicin wurden verwendet, um erwachsenen Wildtyp TuAB Zebrafisch zu verletzen, was zu immer mehr lhx1a + Zellaggregaten in der regenerierenden Nieren (1A - D). Weiß Abgüsse können leicht in das Wasser 1 Tag nach Verletzung (- H 1E) zu sehen. Eine geringe Dosis von Gentamicin in Folge die meist...

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

kidney-regeneration-in-adult-zebrafish-by-gentamicin-induced-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 

Serie: Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Neurowissenschaften

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologie

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Akute Nierenverletzung Modell induziert durch Cisplatin bei erwachsenen Zebrafischen

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...