This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

HINWEIS: Ethics Statement: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Massachusetts General Hospital Richtlinien für Tierversuche in der Forschung durchgeführt. 1. Voraus Vorbereitung <ol><li> Ermitteln Sie, wie viele erwachsenen Zebrafisch 6-12 Monate alt, um zu verletzen. Plan, um 10-20% mehr Fische als benötigt zu verletzen. Um Schwankungen zu minimieren, abgestimmte Einsatz Alter Geschwister Fische in der gleichen Tank gemeinsam aufgezogen, so dass sie ungefähr die gleiche Größe und weniger genetische Variabilität. Weiblichen Fische sind viel einfacher zu injizieren, verglichen mit dem männlichen Fische aufgrund der größeren Kapazität des Bauches. , Männchen und Weibchen geben jedoch ähnliche Ergebnisse. </li><li> Wenn dabei den Versuch zum ersten Mal, eine Dosiskurve zu zeichnen, um die geeignete Dosierung für ein Gentamycin spezifischen Stammes von Fisch zu bestimmen. Testen jeder neuen Charge von Gentamicin vor der Verwendung in Experimenten, da die Reinheit des Gentamicin variiert von Charge zu Charge. Die richtige Dosierung sollte durch die Bewertung expressi bestimmt werdenauf Verletzungsmarker wie lhx1a. (Siehe 1A - D). </li><li> Bereiten Gentamicin-Lösung. Gentamicin-Stammlösung kann in -20 ° C gelagert und zur späteren Verwendung aufgetaut werden. Zum Beispiel für eine 80 mg / kg-Dosis (80 mg Gentamicin / kg Körpergewicht) in einem Fisch einem Gewicht von 0,5 g, herzustellen 2 mg / ml Gentamycin in phosphatgepufferter Salzlösung als eine bequeme Arbeitslösung. Dies stellt eine 20 ul Gentamycin zur intraperitonealen Injektion in den Fisch. HINWEIS: In der Regel 80 bis 120 mg / kg erzielen gute Ergebnisse, aber so geringen Dosen wie 40 mg / kg geeignet sein. Gentamicin kann auch in Lösung erworben werden, um die Exposition gegenüber gefährlichen Laborpersonal zu minimieren. HINWEIS: Gentamicin in hohen Dosen giftig sein können. Tragen Sie Handschuhe und Maske bei einem Gewicht von Pulver. </li><li> Bereiten Sie 100 ml von 0,016% Tricaine Wasser für Anästhesie Fisch. Bereiten Sie eine Bestandsaufnahme 25x Tricaine (4 g / 1 L) in sterilem Milli-Q-Wasser gelöst, auf pH 7 und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Verdünnen Sie 4 ml in 100 ml Wasser für Fisch einer Arbeitskonzentration von 0,016%. HINWEIS: Tricaine ist ein Anästhetikum und hautreizend, Handschuhe bei der Handhabung. </li><li> Machen Sie einen Fisch aus einem Kunststofftransferpipette schöpfen, indem die Lampe in Form einer Kugel und Schneid 2 Steckplätze in den Boden, das Wasser abgeleitet. Last 1 ml Spritzen (mit 10 ul Abstufungen) mit der vorbereiteten Lösung Gentamicin und fügen Sie eine 30½ G Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen. Drehen Sie die Nadel auf die Spritze, um sicherzustellen, dass die gebogene Spitze auf der Nadel abgewandten und die Spritze Markierungen nach vorne und lesbar. Für Steuereinspritzungen, bereiten eine Spritze und Nadel mit sterilem PBS. </li><li> Bereiten Sie eine Skala mit einer sauberen Oberfläche oder wiegen Boot sowie Papierhandtücher zum Trocknen von Fisch und zum Halten von Fisch für die Injektion. </li><li> Bereiten einzelnen kleinen Halbliter-Behälter mit Deckel zur Aufnahme von Fisch zur Beobachtung über Nacht nach der Injektion. Kleinen transparenten Kunststoff Führungskäfige sind für diesen Zweck nützlich. DieseBehälter nicht weiß - im Idealfall sollten sie klar sein, so dass die weißen epithelialen Abgüsse von den Fischschuppen auf einem schwarzen Tischplatte beachten. Füllen Sie jeden Container mit genug Fisch Wasser für die Fische, um bequem zu schwimmen. </li></ol> 2. intraperitoneale Injektion von Gentamicin <ol><li> Betäuben die Fische in 0,016% Tricaine Lösung in Fischwasser. Warten Sie auf den Kiemenventilationsrate zu verlangsamen und die Fische nicht mehr auf Berührung reagieren. </li><li> Schöpfen die Fische mit dem Fisch Schaufel, sich von Kopf zu Schwanz, um nicht zu verletzen, die Kiemen oder Flossen. Den Fisch auf Küchenpapier, um das überschüssige Wasser durch Drehen der Fisch aus sanft auf die Seite aufnehmen und schütteln Sie überschüssiges Wasser aus der Schaufel. </li><li> Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie in die wiegen Boot auf der Skala auf Null gestellt und wiegen die Fische. Runde auf den nächsten 0,25 g, und berechnen Sie die entsprechende Menge an Gentamicin zu injizieren. HINWEIS: Für eine 0,5 g Fisch mit einem 20 &amp; mgr; l Injektion in 80 mg / kg-Dosis. </li><li> Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie auf einer trockenen gefalteten Papiertuch. Wenn die Injektion mit der rechten Hand den Papiertuch in der linken Hand und legen Sie den Kopf des Fisches nach links, mit der Bauch leicht zugänglich. </li><li> Halten Sie die Spritze mit der Nadel in einem 45 ° Winkel auf die Haut des Bauches, anterior der Kloake. Drücken Sie die Nadel unter die Haut, dann den Winkel zu verringern, und schieben Sie die Nadel nach vorne unter die Haut, die Vermeidung der inneren Organe. Drücken Sie den Kolben der entsprechenden Menge, innehalten, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit kommt heraus um die Nadel, dann ziehen Sie die Nadel. Wenn die Fische halten stetigen ist ein Problem, Klammer Ellbogen Oberkörper, um sie zu stabilisieren. HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Gentamicin-Lösung. </li><li> Drop jeden Fisch zu einem individuellen Behälter. Beobachten Sie die Fische und deren Verwertung aus der Narkose. Halten Fisch bei 28,5 ° C über Nacht. HINWEIS: Wenn die Fische nicht sofort wieder zu beleben, mit einem Kunststoff-transfer-Pipette, um Wasser zu bewässern über die Kiemen, um es wieder zu beleben. </li><li> Verwenden Sie die gleiche Spritze und Nadel bei der Injektion mehrere Fische mit der gleichen Dosis von Gentamicin. Entsorgen Sie die Spritze und Nadel in die entsprechende Biohazard Behälter für spitze Gegenstände. </li></ol> 3. Nacheinspritzung Beobachtung der Verletzungen <ol><li> Am nächsten Tag (1 Tag nach der Verletzung), legen Sie die injizierten Fische in ihrem Behälter auf einer dunklen Oberfläche. Weiß Abgüsse von Toten Epithelgewebe von den verletzten Fisch ausgeschieden sollte sichtbar sein. (Siehe Abbildung 1 E - H). Wenn es keine Zylinder entweder der Fisch nicht durch die Gentamicin Injektion verletzt (entweder die Dosierung zu niedrig, oder einige der Gentamicin während des Spritzvorgangs ausgetretene) oder der Fisch wurde ernsthaft verletzt zu einer vollständigen Blockierung der Harnleiter und Kloake mit abgestoßen Gewebe. HINWEIS: Wenn die Fische nicht in der Lage, um die Abgüsse vom Körper es in der Regel innerhalb von 2-3 Tagen sterben, zu löschen und damit unbrauchbar für längereAssays. Wenn keine Zylinder sichtbar sind, einschläfern die Fische in Tricaine Wasser für mindestens 10 min eingetaucht, nachdem gill Bewegung stoppt. </li><li> Wenn weißes Seiden Abgüsse sichtbar sind, stellen Sie den Fisch beiseite und weiterhin die Überprüfung der anderen Fischen. Eine geeignete Dosis von Gentamicin in 80-90% der Fische wobei brauchbaren Ergebnis. Pool des verletzten Fisch und dann teilen sie in verschiedene Behandlungsgruppen, falls gewünscht. </li></ol> 4. Pflege von Einholen von Fisch <ol><li> Halten Fische in sauberes Wasser und menschenleeren Umgebung. Schmutzwasser und Gedränge wird, um Infektionen und ungewollten Tod führen. Versuchen Sie, nicht mehr als 6 Fisch / 500 ml Fisch Wasser täglich, wenn möglich zu halten und das Wasser wechseln. Anmerkung: Dies ist ein Minimalvolumen für die Konservierung der Raum oder der Prüfer wünscht Experimente mit teuren Arzneimittelbehandlungen durchzuführen. </li><li> Haben die Fische zu füttern nicht bis 3 Tage nach der Verletzung. Einholen von Fisch wird zunächst nicht zu essen, und alle Lebensmittel in den Tank zersetzt und fördern Bakterien growth. Ab 3 Tage nach der Verletzung, füttern Sie eine kleine Menge einmal täglich. </li></ol> 5. Analyse der Verletzte Nieren <ol><li> Für in-situ-Hybridisierung für lhx1a mRNA-Expression kann Nieren von Fisch in gewünschten Zeitpunkten geerntet werden. Euthanize Fisch in Tricaine Wasser auf Eis mindestens 10 min bis gill Bewegung stoppt, entfernen Sie dann den Kopf mit einer Rasierklinge und öffnen Sie die Körperhöhle und entfernen Sie die inneren Organe mit einer Pinzette. </li><li> Verlassen Sie die Niere statt (pigmentierte Orgel an der dorsalen Körperwand befestigt) und befestigen Sie den Fisch in 4% Paraformaldehyd in PBS über Nacht. Sezieren die Niere 15 und fahren Sie mit Standard-in-situ-Hybridisierung. <ol><li> Kurz gesagt, wasche die Nieren in PBST (phosphatgepufferte Salzlösung 0,5% Tween 20), mit Proteinase K in PBST (10 ug / ml) für 1 h bei Raumtemperatur permeabilisiert. Post-fix mit 4% Paraformaldehyd und mit PBST gewaschen. </li><li> Dann vorge hybridisieren die Nieren über Nacht bei 68; ° C in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5 × SSC, 50 ug / ml Heparin, 500 ug / ml tRNA, 0,1% Tween20, pH 6,0). </li><li> Die Proben mit Digoxigenin markierten Sonde in Hybridisierungspuffer inkubieren, dann für 5-10 min waschen mit je 100%, 75%, 50%, 25% Hybridisierungspuffer bei 68 ° C, dann in Raumtemperatur und zweimal Waschen für 30 min mit 2 × SSC mit 0,1% Tween 20, und waschen zweimal für 30 min mit 0,2 × SSC mit 0,1% Tween20. </li><li> Äquilibrieren die Probe 3x 5 min in MAB (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) gewaschen und über Nacht bei 4 ° C in MAB mit 10% Ziegenserum blockiert. Dann inkubieren Proben über Nacht in Anti-Digoxigenin-AP Fab 1: 5.000 in MAB. </li><li> Für 1 h in MAB wasche die Probe 5x und äquilibrieren 3x 15 min in NTMT (0,1 M Tris pH 9,5, 0,05 M MgCl 2, 0,01 M NaCl, 50 &amp; mgr; l Tween 20). </li><li> Dann behandeln die Nieren mit NBT / BCIP zu Signal zu erfassen. Befestigen Sie die Nieren mit 4% Paraformaldehyd und in Dimethylformamid inkubiert, um remove überschüssige NBT / BCIP, über Nacht in entionisiertem Wasser gebleicht. Waschen Sie die Nieren und dann in PBST fotografieren mit 50% Glycerin unter einem Deckglas. </li></ol></li></ol>

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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Fogazzi, G. B., Cameron, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+dimorphic+fin+regeneration+in+zebrafish+controlled+by+androgen/GSK3+signaling.">Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling.</a> Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).</li><li>Zhou, W., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+podocyte+injury+and+proteinuria+in+transgenic+zebrafish.">Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+conditional+targeted+podocyte+ablation+and+regeneration.">A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.</a> Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Der Zebrafisch ist ideal für das Studium der Regeneration von erwachsenen Organen, einschließlich der erwachsenen Niere Mesonephros 6. Jüngste Studien haben den Vorteil von molekularen Markern und neuen transgenen Reporter Linien besser zu charakterisieren die Schritte, die während Nephron Regeneration auftreten und welche Zellen verantwortlich 7,12 sein könnten. Beobachtung Harnzylinder ist seit über einem Jahrhundert verwendet, um Nierenerkrankungen beim Menschen 16 zu diagnostiz...

Die Niere ist für die Flüssigkeit Homöostase, Blutdruckregulation und Filtration von Abfall aus dem Körper. Obwohl Säugetiere sind in der Lage, bestehende Nephrone nach Verletzung mit differenzierten Epithelzellen 1-4 reparieren, scheinen sie einen Pool von reservierten Stammzellen 5 fehlt und sind unfähig, neue Nephrone de novo bilden. Im Gegensatz zu Säugetieren, sind erwachsene Fische können neue Nephronen während des Erwachsenenlebens zu bilden, um das Wachstum der Fische und in Reaktion auf eine Verletzung 6,7 unterstützen. Der Zebrafisch, Danio rerio, ist ein unschätzbares Modellorganismus für das Studium der Organregeneration 8-10 und hat das Potenzial, leistungsstarke Einblicke in die Anwendungen für Engineering der Reparatur von menschlichen Nieren zu schaffen. Die Tg (Lhx1a: EGFP) Transgen 11 ist gezeigt worden, um einen Pool von Nephron-Vorläuferzellen im erwachsenen Zebrafisch Nieren 12 kennzeichnen jedoch Mechanismen, die die Reaktion der lhx1a + Zellen verletzungs rEmain unklar. Das Aminoglycosid Gentamicin ist ein häufig verwendetes Antibiotikum mit bekannten nephrotoxischen und ototoxic Wirkungen bei Menschen 13. Intraperitoneale Injektion von Gentamicin ist ein etabliertes Verfahren zur Induktion der akuten Nierenschädigung in Fisch 6. Diese Verletzung in Fisch imitiert den Verlust von Tubulusepithel und Vernarbung der Glomeruli, die nach Gentamicin 14 Dosierung beim Menschen auftritt. Induzieren Schädigung im Zebrafisch Refobacin Injektion ist ein bequemer Weg induzieren eine starke, synchrone Regenerierung Reaktion mit vielen neuen Nephronen erzeugt und gleichzeitig durch die Stufen der Bildung, Proliferation und Differenzierung fortfahren. Dieses Protokoll Details unserer Verfahren für robuste und reproduzierbare Verletzung im erwachsenen Zebrafisch Niere durch die Verwendung eines nicht-invasiven bild Screening-Prozess, um Ausreißer zu minimieren. Wir nutzen die Tatsache, dass Verletzungen mit Gentamicin führt zum Tod von epithelialen Nierengewebe und FormatIon der Nierentubuli Abgüsse, die dann in Massen sammeln sich in den Mesonephros Kanäle und Kloake. Diese werden durch den Fisch geführt und kann visuell im Wasser beobachtet werden. Dies erlaubt uns, für Fische mit stark nicht-tödliche Verletzungen, die dann für weitere Experimente gebündelt werden können screenen. Minimierung der Zahl der unverletzten Fische oder Fische, die vor Erreichen der Endpunkt des Experiments führt zu mehr einheitliche und effiziente Datenerfassung und -analyse zu sterben. Darüber hinaus sind keine speziellen Geräte oder Reagenzien erforderlich, so dass diese Verfahren kostengünstiger und geeigneter für die Verwendung in einem akademischen oder Lehr Einstellung. Mit unserem Verfahren, hier zeigen wir die zunehmenden Auswirkungen von Gentamicin-Dosis auf die Nierenregeneration sowie die Wirkung der erhöhten Temperatur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin sodium sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1264</td>
			<td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic transfer pipets</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 ml Norm-Ject syringes</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">72520</td>
			<td>green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">30G1/2 needles</td>
			<td style="width:101px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td>Make 4% in 1xPBS for working solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Gentamicin Verletzung kann visuell durch Beobachtung der Nierenepithelzellen Abgüsse im Wasser (1) bestätigt werden. Verschiedene Dosierungen von Gentamicin wurden verwendet, um erwachsenen Wildtyp TuAB Zebrafisch zu verletzen, was zu immer mehr lhx1a + Zellaggregaten in der regenerierenden Nieren (1A - D). Weiß Abgüsse können leicht in das Wasser 1 Tag nach Verletzung (- H 1E) zu sehen. Eine geringe Dosis von Gentamicin in Folge die meist...

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

kidney-regeneration-in-adult-zebrafish-by-gentamicin-induced-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 

Serie: Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartikel-vermittelten SiRNA Gen-silencing in Erwachsenen Zebrafisch-Herz

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...