Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants NS-38849 und DK-076160, der Juvenile Diabetes Research Foundation Center for the Study of Diabetes Komplikationen in unterstützt, das Programm für Neurologische Forschung und Entdeckung und die A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Diese Arbeit verwendet die Morphologie und Bildanalyse Kern des Michigan Diabetes Research and Training Center, National Institutes of Health Grants 5P60 DK-20572 vom National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten finanziert. Die Autoren bedanken sich Scott T. Clarke von Molecular Probes / Invitrogen für seine wertvollen Ratschläge über die verschiedenen Click-iT EdU Labeling Kits und die großzügige Spende von Reagenzien, die anfängliche Entwicklung des EdU Amplifikationstechnik unterstützen.

1. Vorbereitung des Neurons <ol><li> Spinalganglion (DRG) Neuronen sind sterile (autoklaviert) 12 mm Deckgläschen in einer 24-well Platte gewachsen. </li><li> Die 10 mM Bestand von Edu (in DMSO, Click-iT EdU Microplate Assay Kit) ist in der Regel 1:100 in Kulturmedium verdünnt, um eine 10X EdU-Lösung (100 nM) zu machen und dann 1:10 verdünnt in die Kultur-Wells (z. B. 30 ul der 10X EdU Lösung in insgesamt 300 ul Kulturmedium). DRG-Neuronen sind mit einer Endkonzentration von 10 uM EdU bei 37 ° C und 5% CO 2 zwischen 2-24 Stunden. Die Länge der Zeit abhängt, wie Behandlungen auf die Rate der mtDNA-Synthese. </li><li> In einer Abzugshaube, sind DRG-Neuronen in 2% Paraformaldehyd für 10-15 min bei Raumtemperatur fixiert, zweimal in 1X PBS 2-5 Minuten jede Wäsche und in frischen 1X PBS für bis zu 1 Monat bei 4 ° C. </li><li> Deckgläser mit spitzen Pinzette, eine vorbereitete feuchte Kammer übertragen (Corning BioAssay Gericht mit schwarzen tapeziert unten für Kontrast, eingewickelt in Alufolie, um Licht empfindliche Bauteile und befeuchtet mit Wasser gesättigt Kimwipes zu schützen) und auf ein Blatt Parafilm M, bietet eine hydrophobe Oberfläche, um die Lösungen zu den Deckglas beschränken. Das Protokoll unten ist für 28 Deckgläser konzipiert und Lösungen sind für 32 Deckgläser (ca. 14% mehr Volumen) vorbereitet. Lösungen mit teuren oder beschränkt Komponenten werden so gefertigt, dass 75-80 ul auf jedem Deckglas verwendet werden. Ansonsten sind 200-300 ul für Wasch-und Block-Lösungen verwendet werden, um gründlich auswaschen bisherigen Lösungen. </li><li> Re-gelten 1X PBS, um die Oberfläche jedes Deckglas (200-300 ul) zu decken. Bereiten Sie die Click-iT-Assay und Tyramid Signalverstärkung Kits, wie unten beschrieben und in den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> Vorbereitung der Click-iT EdU Microplate Assay Kit Die meisten Komponenten aus dem Click-iT EdU Microplate Assay Kit kommen vor und sind bei 4 ° C [2x Click-iT Reaction Buffer (10x Komponente E), CuSO4 (100 mM, Component F), Click-iT EdU Fixativ ( Die Komponente D) und Blocking Buffer (2x Component H)]. Click-iT EdU Buffer Additive (10x Komponente G) wird bei -20 ° C gelagert, um es von sich gelb-braun im Laufe der Zeit zu verhindern. Diese Komponente, wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Die Oregon Green 488 Azid (Komponente B) sollte in kleinen Portionen (10-20 ul) geteilt werden, um Frost-Tau-Zyklen zu minimieren und bei -20 ° C. Zur Vorbereitung einer Stammlösung von der Anti-Oregon Green HRP-Konjugat (Komponente I), fügen Sie 75 ul Milli Q dH 2 O in das Fläschchen. Mix von sanften Pipettieren oder durch Umdrehen Schaumbildung zu vermeiden und lagern bei 4 ° C. Nicht vortexen. Vorbereitung der TSA Kit Nr. 12, mit HRP Goat Anti-Rabbit IgG und Alexa Fluor 488 Tyramid Kit Zur Vorbereitung der Tyramid Stammlösung lösen sich die festen Stoffe (Alexa Fluor 488 Tyramid, Komponente A) in 150 ul DMSO (Komponente B). Drehen Sie die Durchstechflasche einige Male zu lösen jede Tyramid Beschichtung den Seiten des Fläschchens. Lagerung der Stammlösung in kleinen Portionen (10-20 ul) bei ≤ -20 ° C, getrocknet und vor Licht geschützt. 2. Click-iT 5-Ethinyl-2-desoxyuridin (EDU) Labeling Hinweis: Alle Lösungen sind mit einer Glühbirne Transferpipette mit 200 ul Spitze angebracht, um das Ende zu entfernen sanft Flüssigkeiten ohne Zellen entfernt. Vermeiden Sie die Verwendung eines Vakuums Linie, die in der Regel zu entfernen Lösungen zu heftig. Ein Vollpipette wird verwendet, um sanft Flut Deckgläser mit 200-300 ul der Waschlösungen gründlich auswaschen der bisherigen Lösung. <ol><li> Die Zellen werden mit 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer bedeckt permeabilisiert. Verwenden Sie 1% Triton-X-100 Stammlösungen. <ul><li> Machen Sie 3000 &amp;mgr; l 0,1% Triton-X-100 durch Zugabe von 300 ul 1% Triton-X-100 Lager zu 2700μL 1X PBS. </li><li> Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li></ul></li><li> Entfernen Sie den Triton X-100-Lösung und spülen Sie zweimal mit 1X PBS. </li><li> Endogene Peroxidase-Aktivität wird durch eine 1% H 2 O 2 in 1X PBS-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgeschreckt. Verdünnen Sie 30% H 2 O 2-Lösung mit 1X PBS. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden, sondern können während der 10 Minuten Permeabilisierung Schritt vor (Schritt 3,1) vorgenommen werden. <ul><li> Machen Sie 3000 ul einer 1% igen H 2 O 2 durch Zugabe von 100 ul 30% H 2 O 2 bis 2900 ul 1X PBS. </li><li> Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li><li> Entfernen Sie die Peroxidase-Lösung und spülen Sie zweimal mit 1X PBS. </li></ul></li><li> Click-iT EdU Reaction <ul><li> Für 32 Deckgläser (32 x 80 ul =2560 ul) insgesamt von 2560 ul erforderlich ist. Die 2x Reaktion ist in 1280 ul, der die Hälfte des Gesamtvolumens der Reaktion ist. </li><li> Frisch bereitet die Click-iT Reaction Cocktail vor dem Start des 5 Minuten post fix (Schritt 3.5). </li><li> Mischen Sie die Cocktail-und Abpipettieren. Nicht vortexen bei der Bereitstellung dieser Reaktion. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 x Reaction Cocktail Die Komponenten sind von Click-iT EdU Microplate Assay Kit </td><td> Die Hälfte Volume: 1280 ul </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 ul </td></tr><tr><td> 2x Click-iT Reaction Buffer (10x Komponente E) </td><td> 100,3 ul </td></tr><tr><td> Click-iT EdU Buffer Additive (10x Komponente G) </td><td> 25,6 ul </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mM, Component F) </td><td> 25,6 ul </td></tr><tr><td> Oregon Green Azid (Komponente A) </td><td> 6,4 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 1290,7 ul </td></tr></tbody></table> HINWEIS: Die Volumina eingesetzt oben sind proportional zu den Volumina in den Click-iT EdU Microplate Assay Kit Richtungen aufgeführt. Das Endvolumen der Reaktion Cocktail ist etwas mehr als 1280 ul. </li><li> Der 2X Click-iT Reaktion wird mit dem gleichen Volumen von Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) unmittelbar vor der Verwendung verdünnt. Das Mischen dieser zusammen macht eine einheitliche Reaktion Lösung für alle Deckgläser. </li><li> Add 1290,7 uL Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) auf die 1290,7 ul Reaktion Cocktail. Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li></ul></li><li> Post-fix die Neuronen mit Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie fix und fügen Reaktion Cocktail von oben (Schritt 3,4). Abdeckung zum Schutz vor Licht und Inkubation für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig die Reaction Cocktail. Zweimal waschen mit verdünnter 1X Blocking Buffer (2x Component H). <ul><li> Machen Sie 5200 ul 1X Blocking Buffer durch Verdünnung 2600 ul Blocking Buffer (2x Component H) mit dem gleichen Volumen MilliQ d H 2 O (2600 ul). Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li></ul></li><li> Im Rahmen eines epi-Fluoreszenz-Mikroskop für Oregon Green Färbung in den Kernen von mitotisch aktiven Kontroll-Zellen zu überprüfen. </li></ol> 3. Tyramid Signalverstärkung (TSA) der EDU Signal <ol><li> Add 1% TSA-Block-Lösung in jede Deckglas und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. <ul><li> Machen Sie 6000 ul 1% TSA-Block-Lösung durch Wiegen 0,06 g TSA Blocking Reagent (TSA-Kit Nr. 12, Komponente D) und das Hinzufügen zu 6000 ul 1X PBS. Vortex mischen. Zugabe von 5% Ziegenserum in der 1%-TSA-Block-Lösung wird oft dazu beitragen, unspezifische Bindung zu reduzieren. </li></ul></li><li> Kurz Spin der Anti-Oregon Green Meerrettichperoxidase konjugierten Antikörper Lager (Komponente I der Click-iT EdU Microplate Assay), hergestellt 2-24 Stunden im Voraus von TSA. Verdünnen Sie den Primärantikörper 1:300 in 1% TSA blockiert und Invertzuckersirup oder Pipette auf und ab sanft zu mischen. Nicht vortexen zu verhindern, dass die HRP-konjugierten Antikörper. Nehmen Sie 1% TSA-Block-Lösung, fügen Sie 75 &amp;mgr; l jedes Deckglas beimpft und über Nacht bei 4 ° C. <ul><li> Der verwendete Antikörper können mehr konzentriert werden, wie z. B. 1:150, aber es ist in begrenzten Mengen geliefert, so sollten Sie sie sparsam. Auch hier wird der Zugabe von 5% Ziegenserum in der 1%-TSA-Block-Lösung helfen oft unspezifische Bindung des anti-Oregon Green Meerrettichperoxidase konjugierten Antikörper zu reduzieren. </li><li> Machen Sie 2560 ul einer 1:300-Antikörper-Lösung durch Zugabe von 8,53 ul der Aktie Rabbit anti-Oregon Green-HRP (Click-iT EdU Microplate Assay) bis 2560 ul 1% TSA Blocking. Mix von sanften Pipettieren oder Inversion. </li></ul></li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die Antikörper-Lösung und spülen Sie dreimal mit 1X PBS. Inkubieren Sie die Deckgläser in der letzten Wäsche für eine weitere 30-60 Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass ungebundene Primärantikörper entfernt wird. </li><li> Bereiten Tyramid Reaktion von 2560 ul (32 Deckgläser x 80 mL). <ul><li> Machen Sie 400 ul einer 0,15% H 2 O 2-Lösung (100X) durch Zugabe von 2 ul der 30% H 2 O 2 (TSA-Kit Nr. 12, Component F) bis 398 ul Amplification Buffer (TSA-Kit Nr. 12, Komponente E) . Dies sollte unmittelbar vor erforderlich sein. </li><li> Für ein Endvolumen von 2560 ul kombinieren: <ul><li> 25,6 ul Tyramid-488 (TSA-Kit Komponente A) </li><li> 2508,8 uL Amplification Buffer (TSA-Kit Komponente E) </li><li> 25,6 ul 0,15% H 2 O 2 (von oben für eine endgültige 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Entfernen 1X PBS und Inkubation mit dem Tyramid Reaktion für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ul></li></ul></li><li> Entfernen Tyramid Reaktion und spülen dreimal mit 1X PBS, Inkubation in der letzten Wäsche für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur wie zuvor. </li><li> Prüfen Sie, ob mtDNA Kennzeichnung unter einem epi-Fluoreszenz-Mikroskop. <ul><li> Berg Deckgläser auf Objektträger aus Glas mit einem Antifade Eindeckmedium, wie ProLong Gold mit DAPI. Alternativ kann der EDU Kennzeichnung und Verstärkung durch Standard-Leuchtstofflampen Immunzytochemie zu anderen zellulären Marker Etikett beachten. </li></ul></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation als Marker für die mitochondrialen Biogenese Wir sind daran interessiert, wie sensorische Neuronen (Abbildung 1) regelt die Anzahl der Mitochondrien. Dieses Protokoll wird neu synthetisierten mtDNA mit einem fluoreszierenden Marker-Label als eine Möglichkeit zur Messung der neuen Mitochondrien. Die Einbeziehung der synthetische Nukleotid EdU durch die Klick-Chemie der Oregon Green-Azid und nachfolgenden Amplifikation mit den Alexa-Fluor 488 Tyramid Ergebnisse in der Etikettierung von mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals (Abbildung 2). Wenn es richtig gemacht, ist das verstärkte grüne Signal ausreichend höher als Hintergrund-Fluoreszenz (wie zelluläre Autofluoreszenz oder ein Nebeneffekt der HRP-TSA-Reaktion). Diese Technik wurde entwickelt, um neu repliziert mtDNA-Label, um zu visualisieren und zu quantifizieren mtDNA Biogenese in subzellulären Kompartimenten von Neuronen (Abbildung 3). Die EDU Kennzeichnung ermöglicht anschließende Fluoreszenz-Immunzytochemie zu anderen zellulären Marker wie Neurofilament (Abbildung 3D) Label. Die TSA Reaktion kann auch mit anderen fluoreszierenden Alexa Fluor tyramides wie Alexa Fluor 594-Tyramid durchgeführt werden. Daraus ergibt sich ein grün fluoreszierendes nuklearen Signal von der Oregon Green-Azid-Klick-Reaktion in den Zellkern, aber kein grünes Signal in mtDNA, die nachweisbar vor TSA ist. Die Verstärkung mit Alexa Fluor 594-Tyramid intensiviert die nukleare Label und zeigt die eingearbeitet EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal (Abbildung 4). Eine ähnliche Verstärkung Verfahren verwendet wird, um BrdU-Einbau in neu synthetisierte mtDNA (Abbildung 5) sichtbar zu machen, jedoch erfordert diese Methode einen weiteren Schritt auf die BrdU-Epitop entweder durch eine harte Säure (HCl) oder Enzym verdauen, die nicht für EdU notwendig erholen Kennzeichnung. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vertreter Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder von embryonalen (links) und Erwachsenen (rechts) Spinalganglien (DRG) Neuronen, die normalerweise für die Analyse. Bars = 10 pm eingesetzt werden. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung, die die Verfahren zur Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals. Die schematische stellt den Drei-Stufen-Protokoll für die Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals. Mitotisch aktiven F11 Neuroblastom-Zellen dienen als positive Kontrolle und illustrieren die Kennzeichnung Muster EdU, dass in Kern-und Mitochondrien-DNA eingebaut wurde. Der erste Schritt (P1) ist ein Thymidin-Analogon in neu synthetisierte mtDNA integrieren durch Inkubation von Zellen in Anwesenheit von EDU. Der zweite Schritt (P2) wird auf Klick-Chemie eingebaut EdU mit Oregon Green-Azid-Label basiert. Grün-Signal wird sichtbar in den Kernen der Zellen, ihre Kern-DNA repliziert. Der letzte Schritt (P3) ist mit dem Oregon Gr verstärkeneen-Azid-Signal durch Inkubation mit einem HRP-konjugierten Kaninchen-Antikörper gegen Oregon Green gefolgt von Inkubation mit Alexa Fluor 488 markierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu grün-Signal in mtDNA zu visualisieren. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. EdU Kennzeichnung von mtDNA in Spinalganglien (DRG) Neuronen. Neuronen sind mit der EDU inkubiert und das Signal wird anschließend verstärkt auf mtDNA, die eingearbeitet EdU offenbaren. Vertreter Fluoreszenzbilder auf Durchlicht zeigt grün punktförmige Signale verstärkt EDU (Edu-OG-TSA, grün) in neu synthetisierte mtDNA sowohl embryonale (A) und Erwachsenenbildung (BD) DRG-Neuronen aufgenommen überlagert. Die EDU Kennzeichnung Verfahren ermöglicht die anschließende Immunfluoreszenzfärbung der neuronalen Marker wie Neurofilament (D, αNF, in rot). Maßstabsbalken = 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Schematische Darstellung, die die Verfahren zur Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal. Die schematische stellt den Drei-Stufen-Protokoll für die Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal. Mitotisch aktiven F11 Neuroblastom-Zellen dienen als positive Kontrolle und illustrieren die Kennzeichnung Muster EdU, dass in Kern-und Mitochondrien-DNA eingebaut wurde. Der erste Schritt (P1) ist ein Thymidin-Analogon in neu synthetisierte mtDNA integrieren durch Inkubation von Zellen in Anwesenheit von EDU. Der zweite Schritt (P2) wird auf Klick-Chemie eingebaut EdU mit Oregon Green-Azid-Label basiert. Grün-Signal wird sichtbar in den Kernen der Zellen, ihre Kern-DNA repliziert. Der letzte Schritt (P3) ist mit dem Oregon Green-Azid-Signal durch Inkubation mit einem HRP-konjugierten Kaninchen-Antikörper gegen Oregon Green verstärken, gefolgt von Inkubation mit Alexa Fluor 594 markierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu visualisieren rotes Signal in mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. BrdU-Markierung und Tyramid Signalverstärkung mit einem grünen oder roten Fluoreszenz-Signal in mtDNA. Die schematische Darstellung stellt das Verfahren für die Kennzeichnung BrdU in neu synthetisierte mtDNA entweder mit einem grünen oder roten Fluoreszenz-Signal. Ein erster Schritt ist erforderlich, um die BrdU-Epitop entweder durch eine Säure (HCl) oder Enzym verdauen, die nicht notwendig ist für EdU Kennzeichnung erholen. Der nächste Schritt ist mit einer Maus primären anti-BrdU-Antikörper inkubiert. Dies wird durch Inkubation mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziege anti-Maus-Antikörper. Schließlich wird das Signal mit einem grünen oder roten fluoreszenzmarkierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu signalisieren, in mtDNA visualisieren verstärkt.

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+[(3)H]thymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations.">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li><li>Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels.">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Ethynyl-2'-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea.">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

Wir entwickelten eine sensitive Assay neu synthetisierten mtDNA in einzelnen Zellen mit einem Tyramid Signalverstärkung von EDU-Label. Eines der größten Probleme bei der Optimierung dieses Protokolls war die inkonsistente Ergebnisse zwischen Deckgläsern. Es wurden Änderungen an der Invitrogen Kit-Protokolle, um zu verhindern Mischen kleiner Volumina einzelner Deckgläser und macht Master-Lösungen für alle Deckgläser verwendet werden. Die 75-80 ul für jeden 12 mm runden Deckglas verwendet ist ein ideales Volumen vollständig bedecken die Oberfläche und bietet genügend Lösung, um konsistente Ergebnisse zwischen den Proben zu geben. Inkubationszeiten und Reagenz-Konzentrationen wurden optimiert, sondern Verbesserungen könnten durch die Einstellung von ihnen gesehen zu werden. Das Protokoll wurde entwickelt, um jeden Prozess einmal durchlaufen. Allerdings haben einige der Schritte, mit neuen Lösungen wiederholt, um Proben, die nach dem ersten Versuch gescheitert zu erholen. Insbesondere haben die EDU klicken Reaktionsschritte (3,4-3,6), ohne einen signifikanten Anstieg in Hintergrundfluoreszenz wiederholt worden. Die Anti-Oregon Green-HRP Antikörper-Inkubation (4.1-4.3) und die Tyramid Verstärkung (4,4-4,5) wurden ebenfalls Schritte wiederholt, aber immer häufiger zu einem schlechten Signal-Rausch-Verhältnis wegen des erhöhten Hintergrundfluoreszenz. Die empfindlichsten Reagenzien sind die Click-iT EdU Buffer Additive (Komponente G) und dem Kaninchen-Anti-Oregon Green-HRP Antikörper (Komponente I) von der Click-iT EdU Microplate Assay-Kit. Die Click-iT EdU Buffer Additive färbt sich allmählich gelb im Laufe der Zeit bei 4 ° C gelagert und zwischen 6-12 Monaten merklich dunkler,. Die Lagerung der Click-iT EdU Buffer Additive bei -20 ° C wird zur Lösung dieses Problem. Die Kennzeichnung und Tyramid Verstärkung Schritte funktionieren am besten, wenn die Kaninchen-Anti-Oregon Green-HRP-Antikörper innerhalb von 4-6 Monaten Neugründung in MilliQ dH 2 O wird verwendet, Das milde Kennzeichnung von Edu in mtDNA erlaubt den direkten Vergleich mit weiteren zellulären Marker 9-11 und steigert den Nutzen dieser Technik gegenüber anderen Thymidin-Analoga, wie 5-Bromo-2-desoxyuridin (BrdU), die eine harte Behandlung zur Wiederherstellung erfordert sein Epitop innerhalb der DNA. Unser Labor 11-12 und 13-15 andere haben erfolgreich BrdU zur mtDNA-Label. Die BrdU-Markierung Technik ist ähnlich dem für EdU verwendet, hat aber einige wichtige Unterschiede (Abbildung 5). Nach der Permeabilisierung Schritt oben genannten (3,1-3,2), ist der BrdU-Epitop mit einem Denaturierungsschritt erholt (2 N HCl für 30 min bei 37 ° C durch drei Wäschen in 1X PBS). Die BrdU wird dann mit einem primären Antikörper gegen BrdU markierte (Vector Laboratories 1:50 in 1% Blocking-Lösung aus dem TSA-Kit und inkubiert über Nacht bei 4 ° C). Ein sekundärer Antikörper Schritt ist notwendig, um die BrdU-Signal (Ziege anti-Maus IgG, konjugiert mit HRP von der TSA-Kits # 2 und # 5, 1:100 verdünnt in 1% Blocking-Lösung inkubiert und für 45 min bei Raumtemperatur), bevor verstärken die TSA Schritte (4,3-4,5 oben). Mit zwei Thymidinanaloga, Edu und BrdU, zu beschriften mtDNA ist vorteilhaft für die Durchführung von Dual-Label Experimente, in denen mtDNA nacheinander in Puls-Kennzeichnung Paradigmen 11 bezeichnet werden kann. Unser Labor ist mit der EDU und BrdU-Markierung der mtDNA, die Regulierung der mitochondrialen Biogenese im Rahmen der diabetischen Neuropathie, eine häufige Komplikation des Diabetes zu untersuchen. Wir haben erfolgreich die Signalverstärkung verwendet, um Änderungen in mtDNA Biogenese in einzelnen Neuronen 11-12 zu messen. Diese Technik wird in anderen Experimenten entwickelt, um die Mechanismen der mtDNA-Replikation und Umsatz oder zur Identifizierung von Drogen, die mtDNA-Synthese zu hemmen erkunden nützlich. Darüber hinaus können die Grundprinzipien der Verstärkung Edu und BrdU-Signale zu anderen Studien angewendet werden, messen die DNA-Replikation oder Reparatur.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

Mitochondrien sind wichtige Regulatoren der zellulären Energie-und mitochondrialen Biogenese ist ein wesentlicher Bestandteil der Regulierung Mitochondrien Zahlen in gesunden Zellen 1-3. Ein Ansatz für die Überwachung der mitochondrialen Biogenese ist die Rate der mitochondrialen DNA (mtDNA) Replikation 4 zu messen. Wir entwickelten eine empfindliche Technik zur neu synthetisierten mtDNA in einzelne Zellen markieren, um mtDNA Biogenese zu studieren. Die Technik vereint die Aufnahme von 5-Ethinyl-2&#39;-desoxyuridin (EDU) 5-7 mit einem Tyramid Signalverstärkung (TSA) 8 Protokoll zur mtDNA-Replikation in subzellulären Kompartimenten von Neuronen zu visualisieren. Edu ist besser als bei anderen Thymidin-Analoga, wie 5-Bromo-2-desoxyuridin (BrdU), weil die ersten Klick Reaktion auf Etikett EdU 5-7 nicht erforderlich ist die harte Säure-Behandlungen oder Enzym verdaut, dass für das Freilegen der BrdU-Epitop erforderlich sind . Die milderen Kennzeichnung EdU ermöglicht den direkten Vergleich ihrer Gründung mit anderen zellulären Marker 9-10. Die Fähigkeit zu visualisieren und zu quantifizieren mtDNA Biogenese bietet ein wesentliches Instrument für die Untersuchung der Mechanismen zur mitochondrialen Biogenese regulieren und einen Einblick in die Pathogenese mit Medikamententoxizität, Alterung, Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen verbundene Dienstleistungen zu erbringen. Unsere Technik ist für sensorische Neuronen sowie andere Zelltypen. Der Einsatz dieser Technik auf mtDNA Biogenese Maßnahme hat erhebliche Auswirkungen in der Förderung des Verständnisses der beiden normalen zellulären Physiologie sowie beeinträchtigt Erkrankungen.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Wir entwickelten eine empfindliche Technik zur neu synthetisierten mitochondrialen DNA (mtDNA) in einzelne Zellen markieren, um mtDNA Biogenese zu studieren. Die Technik verbindet die Einbeziehung von EDU zusammen mit einem Tyramid Signalverstärkung (TSA) Protokoll, um mtDNA Replikation innerhalb subzellulären Kompartimenten von Neuronen zu visualisieren.

Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation in einzelnen Zellen von Edu Signalverstärkung

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K Aufrufe.  University of Michigan. Wir entwickelten eine empfindliche Technik zur neu synthetisierten mitochondrialen DNA (mtDNA) in einzelne Zellen markieren, um mtDNA Biogenese zu studieren. Die Technik verbindet die Einbeziehung von EDU zusammen mit einem Tyramid Signalverstärkung (TSA) Protokoll, um mtDNA Replikation innerhalb subzellulären Kompartimenten von Neuronen zu visualisieren.

Serie: Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Automatisierte Interactive Video Playback für Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Säugetier-Rinde

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.