Die Finanzierung wurde durch die National Institutes of Health (EB 001013), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und Canadian Institutes of Health Research. Wir danken Herrn Dr. AP McGuigan für ihr Know-how und helfen bei der Entwicklung von Modulen.

1) Herstellung der Rohre <ol><li> Cut 2 bis 3 m Länge aus Polyethylen-Schlauch (0,76 mm ID x 1,22 mm OD). </li><li> Thema einem 20 G1 Nadel in das eine Ende des Schlauchs. </li><li> Coil den Schlauch und in einen Wandler selbst Dichtung Beutel (7 1 / 2 &quot;x 13&quot;). Die beiden Enden des Rohres sollte an der unverschlossenen Ende der Tasche platziert werden und mit Klebeband statt mit Gas-Sterilisation Band. </li><li> Seal Beutel und Gas sterilisieren. </li></ol> 2) Neutralisation von Collagen Anmerkung: 1 ml Kollagen füllt ca. 2 m von PE-Rohre. <ol><li> Legen Sie die erforderliche Menge von Kollagen für die gewünschte Länge des Schlauchs in ein konisches 15 ml Tube benötigt und halten auf dem Eis. </li><li> Mit 128 uL 10x α-MEM pro ml Kollagen mit dem Rohr und mischen durch mehrmaliges Pipettieren der Lösung. Hinweis: (1) Die Lösung sollte gelb wie die α-MEM gemischt ist in der angesäuerten Kollagen und (2) versuchen, Blasen zu minimieren beim Mischen. </li><li> Neutralisieren der Kollagen durch Zugabe von 0,8 M Natriumbicarbonat, bis das Kollagen hat einen pH von 7,4. Für eine allgemeine Schätzung des pH add Natriumbicarbonat, bis die gelbe Kollagenlösung wird eine hellrosa Farbe. Hinweis: Es dauert in der Regel 30 bis 60 ul pro ml Kollagen. </li><li> Halten Sie neutralisiert Kollagen auf Eis, bis bereit, als die neutralisierten Kollagen-Gel verwenden, wenn nicht bei 4 ° C gehalten </li></ol> 3) Einbettung der Zellen (Optional) Hinweis: Je nach Zelltyp können die Zellen bei einer Konzentration zwischen 1 Million Zellen pro ml bis 20 Millionen Zellen pro mL eingebettet werden. Verwenden Sie das Medium für die Zellen, die Sie einbetten möchten erforderlich. <ol><li> Entfernen Sie das Medium von den Zellen und wäscht mit 5 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 3 mL Trypsin-EDTA. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Die Zellen in 7 mL Medien. </li><li> Zählen von Zellen. </li><li> Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen für die Einbettung in ein 15 ml konischen Rohr. </li><li> Pellet die Zellen bei 300 xg für 5 min. </li><li> Saugen Sie Medien aus dem Zellpellet. </li><li> Resuspendieren der Zellen in der neutralisierten Kollagen und halten auf dem Eis. </li></ol> 4) Gelling von Collagen <ol><li> In einer biologischen Sicherheitswerkbank abgeschnitten verschlossenen Ende der Beutel mit der PE-Rohre. </li><li> Bringen Sie ein 3-ml-Spritze, die 20G Nadel in das eine Ende des Schlauchs mit sterilisierten Pinzette. Halten Sie den Schlauch in der Tasche. </li><li> Stecken Sie das andere Ende des Schlauches in der neutralisierten Kollagen, bis die Spitze ist an der Unterseite der konischen Rohr mit sterilisierten Pinzette. Halten Sie die konischen Rohr auf Eis. </li><li> Ziehen Sie das Kollagen in der Polyethylen-Rohr durch Zurückziehen der Kolben der Spritze langsam. Hinweis: Wenn das Kollagen in den Schlauch gezogen, um schnell dann Blasen in das Kollagen zu bilden. </li><li> Nach dem Herausziehen des Kollagens durch den Schlauch, ziehen Sie die 20G Nadel aus Schläuchen und legte beide Enden wieder in die Tasche. Kleben Sie die Tüte verschlossen. </li><li> Inkubieren Sie die Tasche bei 37 ° C für 60 min. Wenn das Kollagen enthält Zellen dann drehen Sie den Beutel über alle 15 min. so dass die Zellen nicht auf eine Seite des Moduls zu begleichen. </li></ol> 5) Schneiden von Tubing mit der gelierten Collagen <ol><li> Autoclave Kopf-und Blade für die Schneidvorrichtung und Fach-Schlauch zu halten. </li><li> Montieren Sie die Schneidvorrichtung. </li><li> Legen Sie Schlauch in ein steriles Tablett vor Schneideinrichtung und laden Sie den Schlauch in die Schneidvorrichtung. </li><li> Richten Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit 25 ml Medien am Ausgang der Schneidvorrichtung, um den Schnitt-Module sammeln. Hinweis: Verwenden Sie Medien, die FBS auch für Kollagen-only-Module wie die Module nicht getrennt von den Schlauch ohne FBS in den Medien. Wenn die Module enthalten Zellen nutzen die Medien für den Embedded-Zellen erforderlich ist. Wenn es keine eingebetteten Zellen in den Modulen nutzen die Medien für den Endothelzellen. </li><li> Stellen Sie die Schneidevorrichtung zu 2 mm Rohrlängen zu senken und den Schlauch. </li><li> Inkubieren geschnitten Module bei 37 ° C für 60 min in der 50 ml konischen Rohr. </li></ol> 6) Entfernen Collagen-Module von Tubing <ol><li> Vortex 50 ml konische Röhrchen mit Modulen in den Schlauch für 10 sek. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, wenn die Trennung Module mit hoher Zelldichte eingebettet, um ein Brechen zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie Module an den Boden des Röhrchens absetzen. Gehzeit: ca. 5 min. </li><li> Mit einem breiten Mund 10 mL serologischen Pipette übertragen ständiger Module in ein 15 ml konischen Rohr. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,1 bis 6,3 zweimal. </li><li> Gehe zu 7 zu beschichten Module Schritt mit Endothelzellen oder Transfer-Module zu einer nicht-Gewebekulturen behandelte Platte. </li></ol> 7) Die Beschichtung der Module mit Endothelzellen <ol><li> Settle-Module in den Boden eines 15 ml konische Röhrchen mit 5 ml Medium für the eingebetteten Zellen. </li><li> Entfernen Sie das Medium von den Endothelzellen und wäscht mit 5 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 3 mL Trypsin-EDTA. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Die Zellen in 7 mL Medien. </li><li> Zählen von Zellen. Brauchen 5x10 6 Endothelzellen pro ml verpackt Module an der Unterseite der konischen Rohr. </li><li> Pellet die Zellen bei 300 xg für 5 min und Resuspendieren in 5 mL Endothelzellen Medien. </li><li> Fügen Sie die 5 mL der Medien mit Endothelzellen zu den Modulen. Hinweis: Dies ergibt eine 50:50-Verhältnis der beiden Medien-Typen, die wir gefunden haben, die für das Überleben und die Funktion der beiden Zelltypen zu arbeiten. Testen Sie die Verwendung eines Co-Kulturmedium, das die richtigen Wartung von Phänotypen der beiden Zelltypen vor der Verwendung zu gewährleisten. </li><li> Inkubieren Sie die Module mit den Endothelzellen sowohl statisch als auch dynamisch. </li><li> Für statische Inkubation Mix Module mit Endothelzellen durch Inversion, und setzen Sie die Röhre aufrecht bei 37 ° C für 15 min. Wiederholen. </li><li> Dynamisch Samen der Endothelzellen durch sanftes Schütteln der Röhre bei 37 ° C für 60 min. </li><li> Wiederholen Sie die statische Inkubation zweimal. </li><li> Halten Sie die Module in einer nicht-Gewebekulturen behandelte Platte beimpft und über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag legen Sie die Module in eine neue nicht-Gewebekulturen behandelte Platte mit frischem Medium (50:50 mischen, wenn mit Co-Kultur-System), um ungebundene endothelialen Zellen zu entfernen. </li><li> Inkubieren Module, die mit Endothelzellen beschichtet sind, bis sie 100% der Oberfläche der Module decken. Dies dauert in der Regel etwa 7 Tage. </li></ol> 8) repräsentative Ergebnisse: Die Module werden schauen zylindrischen, wenn sie zum ersten Mal aus der Tube entfernt werden. Wenn die Module eingebetteten Zellen enthalten und / oder sind mit Endothelzellen beschichtet sie Vertrag bis zu 50% im Volumen und entwickeln eine ovale Form (Abb. 1). Die Module werden auch zu dichter und undurchsichtig, wenn sie durch Licht-Mikroskopie (Abbildung 1) angesehen. Auch wenn die Endothelzellen konfluent auf der Oberfläche der Module gibt es eine Bildung von Tight Junctions, die durch Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin (Abb. 2) zu sehen ist. Stofftransport Analyse hat gezeigt, dass die Module unterstützen können hohe Zelldichten (8x10 7 Zellen / cm 3), ohne die Entwicklung einer nekrotischen Kern aufgrund unzureichender Sauerstoff zu transportieren, die oft in größeren Gewebe problematisch (zB Module mit großem Durchmesser, D = 1,4 sind mm) (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Module Fertigung und Kontraktion. Module Kontraktion während der drei Tage nach der HUVEC-C (Endothel-Zelllinie) aufgetreten Aussaat Ergebnisse wesentlich kleineres Modul Durchmesser und Länge (p &lt;0,001) (A). Embedded HepG2-Zellen wurden gleichmäßig innerhalb von Modulen zum Zeitpunkt der Herstellung ausgeschüttete und einbehaltene hohe Lebensfähigkeit (B). [Live-Zellen grün; toten Zellen rot] [von Corstorphine 2010 angepasst] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: VE-Cadherin Immunfluoreszenzfärbung der EG enge Zellkontakte von 10 Tagen nach RAEC, wo auf der Oberfläche eines Moduls beschichtet. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Masson-Färbung von typischen Modulen (0,76 mm anfänglichen Durchmesser) und große Module (1,4 mm anfänglichen Durchmesser) zeigen die Wirkung der Sauerstoff-Diffusion Einschränkungen. Sieben Tage nach Herstellung, hatte eine große Anzahl von toten Zellen in den Kern der großen Modulen (unten rechts) gebildet, so dass nur ein dünner Rand (~ 200 um dick) der lebensfähigen Zellen. Umgekehrt erhalten die kleinen Module ein einheitliches und hohes Vertrieb von lebenden Zellen. [Module mit HepG2 Zellen eingebettet und beschichtet mit Endothelzellen.] [Von Corstorphine 2010 getroffen] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: (A) HMEC-1 ausgesät auf Poloxamin - Kollagen-Module. Nach Tag 1 der Aussaat der Poloxamin-Kollagen-Module behalten ihre zylindrische Form und gibt es nur begrenzte Zelladhäsion Eigenschaften im Vergleich zu Kollagen nur Module. Maßstab = 200 um. (B) Lichtmikroskopische Aufnahme einer Kollagen-Modul mit PLGA-biologisch abbaubaren Mikrosphären. Maßstab = 500 um. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Beispiele für in-vitro-Assays. (A) Angiogenese-Assay: Kapillar-Formationen auf dem Modul mit Endothelzellen besiedelt werden leicht erkannt und quantifiziert werden nach 5 Tagen Inkubation mit aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. (B) Konfokale Mikroskopie-Aufnahmen eines Live / Dead Assay On-Module, wo die sTaining für lebende Zellen ist grün und tote Zellen rot. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6: Collagen-Module mit eingebetteten mesenchymalen Stammzellen und einer Oberflächenschicht aus Endothelzellen. Module wurden Schubspannung (~ 0,64 dyn / cm 2) für 7 Tage in einem mikrofluidischen Kammer ausgesetzt und beginnen zu Fusion am Berührungspunkte zeigen. Endothelzellen sind mit vWF (braun) gefärbt und mesenchymalen Stammzellen Kerne erscheinen blau (H &amp; E). Maßstab = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7: Hunderte von Kollagen-Module enthalten, aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) und beschichtet mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC) werden unter die Haut von Mäusen zu ASC / HMEC Interaktion in vivo für Fett Regeneration Anwendungen Studie implantiert.

<ol>
	<li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules.">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li><li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells.">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li><li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats.">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li><li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells.">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+[corrected].">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion.">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+tissue+engineering:+fabrication+of+a+gelatin-based+construct.">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering.">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct.">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules.">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li><li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen/poloxamine+hydrogels:+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells.">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li></ol>

Wir haben verschiedene Mikro-Gewebe Verwendung von Modulen mit unterschiedlichen Zelltypen 1-11 embedded hergestellt. Wir haben erfolgreich primären Kardiomyozyten, Inselchen, Stammzellen aus Fettgewebe und mesenchymale Stromazellen sowie mehrere Zelllinien einschließlich HepG2, NIH 3T3 und Klon 9 Leberzellen eingebettet. Wir haben die Module mit mehreren Arten von Endothelzellen einschließlich Ratte Endothelzellen, HUVEC-Zellen und humanen mikrovaskulären Endothelzellen beschichtet. Die Module sind auch ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Intramedic tubing PE60</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickson</td>
<td>427416</td>
<td>Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>20012-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane</td>
<td>5005-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20G needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickson</td>
<td>305175</td>
<td>Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing</td>
</tr>
<tr>
<td>3 mL syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2&#x201D; x 13&#x201D;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cardinal Health</td>
<td>92713</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Wide Tip serological pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml serological pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357551</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 ml serological pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357543</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micro-tissues using modules of collagen gel containing cells

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einer Art Mikro-Gewebe Module genannt. Die Modul-Ansatz generiert einheitliche, skalierbare und vaskularisierten Geweben. Die Module können von Kollagen sowie andere gelierbare oder vernetzbare Materialien hergestellt werden. Sie sind ca. 2 mm in der Länge und 0,7 mm Durchmesser auf Herstellung, sondern schrumpfen in Größe mit eingebetteten Zellen oder, wenn die Module sind mit Endothelzellen beschichtet. Die Module sind einzeln klein genug, dass die eingebetteten Zellen innerhalb der Diffusions-Limit von Sauerstoff und anderen Nährstoffen sind, sondern Module können zusammen verpackt werden, um größere Gewebe, perfundierbaren sind zu bilden. Diese Gewebe sind modular aufgebaut, da verschiedene Zelltypen in eingebettet werden kann oder beschichtet auf den Modulen, bevor sie zusammen, um komplexe Gewebe zu bilden verpackt werden. Es gibt drei wesentliche Schritte zu machen die Module: (1) Neutralisieren der Kollagen-und Einbettung Zellen in ihr, (2) Geliermittel das Kollagen in die Röhre und Schneiden der Module und (3) Beschichtung der Module mit Endothelzellen.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells at JoVE.com

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Erstellung von Mikro-Gewebe mit zylindrischen Kollagengelen, Module genannt, die eingebetteten Zellen und die Oberfläche enthalten ist mit Endothelzellen beschichtet.

Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

fabrication-micro-tissues-using-modules-collagen-gel-containing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.7K Aufrufe.  University of Toronto. Erstellung von Mikro-Gewebe mit zylindrischen Kollagengelen, Module genannt, die eingebetteten Zellen und die Oberfläche enthalten ist mit Endothelzellen beschichtet.

Serie: Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imaging denaturierten Kollagen-Stränge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Über die Photo-ausgelöst Hybridisierung von Caged Collagen mimetischen Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Forschung

Biotechnik

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Vorbereitung und photoakustische Analyse von Zell Fahrzeuge, die Gold-Nanostäbchen

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Forming Gigantismus Polymersome Mit Gel-unterstützte Rehydrierung

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Herstellung und Charakterisierung von optischen Gewebe Phantome, die Makrostruktur enthalten

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...