Diese Methode ermöglicht es uns, 3D-Kollagen-Hydrogele mit kontrollierter Faserausrichtung zu entwickeln, um Umgebungen zu modellieren, die in gesundem und krankem Gewebe im Körper vorkommen. Diese Technik bietet einen einfachen mikrofluidischen Ansatz, um ausgerichtete Kollagen-Hydrogele zu entwickeln, Zellen einzuführen und zu quantifizieren, wie sich Zellen in topografisch definierten 3D-Umgebungen verhalten. Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly und Justin Vidas werden das Verfahren für mein Labor demonstrieren.
Montieren Sie zunächst eine 250 Mikrometer dicke PDMS-Folie auf einen Kunststoffträger und schneiden Sie das mikrofluidische Design mit einem Bastelschneider bei einer Klingentiefe von 0,5 Millimetern, einer Geschwindigkeit von einem Zentimeter pro Sekunde und hoher Kraft. Reinigen Sie die mikrofluidischen Kanalausschnitte mit einem Ultraschallbad fünf Minuten lang. Spülen Sie die beschallten Kanäle in deionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie fünf Minuten lang auf einer heißen Platte bei 100 Grad Celsius.
Bewahren Sie die Kanäle bis zum Gebrauch in einer sauberen, abgedeckten Petrischale auf. Um die PDMS-Deckschicht herzustellen und die Oberfläche für zukünftige Modifikationen zu funktionalisieren, wird eine 2%ige Aminopropyltriethoxysilanlösung in einem Glasbecherglas hergestellt, indem ein Milliliter Aminopropyltriethoxysilan zu 49 Millilitern Aceton hinzugefügt wird. Als nächstes wird eine 25%ige Glutaraldehydlösung in deionisiertem Wasser auf 5% verdünnt.
Machen Sie zwei Milliliter Lösung für jeweils 24 Millimeter mal 50 Millimeter Deckglas. Reinigen Sie die Deckgläser fünf Minuten lang in einem Bad-Ultraschallgerät mit IPA. Spülen Sie das IPA mit deionisiertem Wasser von den Deckgläsern ab.
Ein glatter Wasserfilm auf dem Deckglas zeigt an, dass das IPA gründlich gespült wurde. Trocknen Sie die Deckgläser fünf Minuten lang auf einer heißen Platte bei 100 Grad Celsius. Legen Sie die getrockneten Deckgläser in saubere Petrischalen und achten Sie darauf, dass sie sich nicht überlappen.
Setzen Sie die Deckgläser mit einem Koronaentladungsstab jeweils eine Minute lang einer Koronaentladung aus. Entfernen Sie die Deckgläser innerhalb von fünf Minuten nach der Koronaexposition und tauchen Sie jedes Deckglas 10 Sekunden lang in die Aminopropyltriethoxysilanlösung, um sicherzustellen, dass das Deckglas eingetaucht ist Entfernen Sie dann die Deckgläser aus der Aminopropyltriethoxysilanlösung, tauchen Sie sie 10 Sekunden lang in Aceton und trocknen Sie sie mit Druckluft. Legen Sie das trockene Deckglas mit der behandelten Seite nach oben zurück in die Petrischale.
Pipettieren Sie einen Milliliter Glutaraldehydlösung auf die Oberfläche jedes Deckglases. Decken Sie so viel Oberfläche wie möglich ab, ohne dass die Lösung über den Rand des Deckglases verschüttet wird. Lassen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit der Lösung in Kontakt und spülen Sie sie dann 20 Sekunden lang mit deionisiertem Wasser ab.
Trocknen Sie die Deckgläser mit Druckluft und legen Sie sie mit der plasmabehandelten Seite nach oben wieder in die Petrischalen Um den modularen Magnetfuß mit dem Laserschneiden zu schneiden, schneiden Sie die Designs mit geeigneten Lasereinstellungen, wie z. B. Anzahl der Durchgänge und Leistung, aus der PMMA-Schicht aus. Die Lasereinstellungen sollten so eingestellt werden, dass die Magnete in die PMMA-Schicht eingepresst werden können. Waschen Sie das lasergeschnittene Teil mit Wasser und Seife, um Schmutz aus dem Laserschneidprozess zu entfernen.
Verwenden Sie keine Lösungsmittel, da diese Mikrorisse in den lasergeschnittenen Kanten verursachen können. Um die Plattform zu montieren, schieben Sie Magnete von Hand in den lasergeschnittenen Sockel. Die Dicke der Magnete muss geringer sein als die Dicke des PMMA-Sockels, um sicherzustellen, dass die Magnete bündig mit der Oberfläche des Sockels abschließen.
Ziehen Sie den Träger vom Haftkleber oder der PSA-Folie ab und befestigen Sie die Basis mit der funktionalisierten Seite nach oben an einem mit Glutaraldehyd behandelten Deckglas. Platzieren Sie den PDMS-Kanalausschnitt vorsichtig in dem durch den Rahmen definierten Hohlraum. Drücken Sie mit einer Pinzette mit breiter Spitze nach unten, um Luftblasen zu entfernen und einen konformen Kontakt zu gewährleisten.
Legen Sie das Rinderserumalbumin oder die BSA-behandelte Kanalabdeckung mit der BSA-Seite nach unten auf den Kanalausschnitt. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeitseinlass- und -auslassöffnungen mit dem Kanal ausgerichtet sind. Das Gerät ist bereit für die Kollagen-I-Injektion.
Setzen Sie eine Spritzenpumpe, eine gekühlte sterile Spritze, eine gekühlte neutralisierte Kollagen-I-Lösung und eine sterile 20-Gauge-Luer-Lock-Nadel mit 90-Grad-Winkelspitze in einen Biosicherheitsschrank ein. Füllen Sie die Kollagen-I-Lösung in die Spritze und vermeiden Sie Blasen. Befestigen Sie die Nadelspitze an der Spritze, laden Sie die Spritze mit der Nadel nach unten in die Spritzenpumpe und grundieren Sie die Nadel mit Kollagen-I-Lösung.
Stellen Sie die Spritzenpumpe auf die erforderliche Durchflussrate zwischen 50 und 2.000 Mikrolitern pro Minute ein. Legen Sie vorbereitete PDMS-Kanäle auf eine Laborbuchse und richten Sie sie mit der Nadel aus. Führen Sie die Nadel in die Einlassöffnung des PDMS-Kanals ein.
Injizieren Sie den Kanal, bis sich ein 30-Mikroliter-Tropfen Kollagen I auf der Auslassseite sammelt. Senken Sie die Laborbuchse ab und trennen Sie die Nadel vorsichtig vom neu gefüllten Kanal. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Kanäle mit Kollagen-I-Lösung gefüllt sind.
Füllen Sie die gefüllten Kanäle zusammen mit einem sauberen, fusselfreien Tuch, das mit deionisiertem Wasser gesättigt ist, in die Petrischale, um ein Austrocknen des neu gebildeten Kollagen-I-Gels zu verhindern. Decken Sie die Petrischale ab und legen Sie die beladenen Kanäle vor dem Abziehschritt zwei Stunden lang in den Inkubator. Heben Sie zum Abziehen und zum Medienausgleich zunächst die PDMS-Abdeckung mit einer Pinzette ab, um das polymerisierte Kollagen-I-Gel freizulegen.
Geben Sie 650 Mikroliter endotheliale Wachstumsmedien in die Vertiefung. Alternativ können Sie ein weiteres Modul anbringen, um eine zusätzliche Kollagenschicht einzuführen oder Medienperfusionsfunktionen bereitzustellen. Lassen Sie die Geräte mindestens vier Stunden im Inkubator, um das Gel und das Medium auszugleichen.
Ersetzen Sie das Medium vor dem Aussäen durch Zellen. Die Funktionalisierung des Glasdeckglases ermöglichte das Abheben des Kanals und die Funktionalisierung der PDMS-Abdeckung mit BSA verhinderte die Anhaftung von Kollagen I. Die Ausrichtung der Kollagen-I-Fasern blieb nach dem Abheben des Deckels unbeeinflusst.
Bilder der HUVECs, die auf dem ausgerichteten Segment der Matrix kultiviert wurden, zeigten eine erhöhte Ausrichtung der Aktinfasern im Vergleich zu den HUVECs auf dem Segment mit zufälligen Fasern. Unser Ansatz ermöglicht es uns, die Mikroumgebung des Tumors zu modellieren und zu quantifizieren, wie verschiedene Zelltypen reagieren. Wir können auch Strömungskanäle einführen, um Langzeitexperimente zu unterstützen.
