1. Die Bedeutung der Zellzählung <ol><li> Zählen von Zellen ist eine notwendige, aber lästige Schritt für In-vitro-Zellkultur. </li><li> Konsequente Zellkonzentrationen sicherzustellen experimentelle Reproduzierbarkeit und Genauigkeit. </li><li> Die Zellzahlen sind wichtig für die Überwachung der Zelle Gesundheits-und Proliferationsrate, die Beurteilung Immortalisierung oder Transformation, säen die Zellen für nachfolgende Experimente, die Transfektion oder Infektion, und die Vorbereitung für die Zell-basierte Assays. </li><li> Trotz der Notwendigkeit einer Geschwindigkeit und Genauigkeit in Zellzählung,, 71% von 400 befragten Forscher zählen Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Während hemocytometry ist billig, es ist mühsam und unter user bias und Missbrauch, die zu ungenauen Ergebnissen zählt. </li><li> Fehlerquellen in hemocytometry gehören: unebene Zelle in der Probe, zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe, subjektive Entscheidungen, ob eine bestimmte Zelle innerhalb der definierten Zählen Bereich fällt, eine Kontamination der Zählkammer, User-to-User-Variante und Variation der Zählkammer Füllrate. </li><li> Zur Linderung der Langeweile mit manuellen Zählung verbunden sind, zählen 29% der Forscher Zellen mit Hilfe von automatisierten Zellzählung Geräte. Doch für die meisten Forscher, ist der Preis, mit diesen großen Tisch-Instrumenten verbundenen ein Hindernis für ihre Verwendung. </li><li> Das Zepter cell counter ist ein automatisiertes Handheld-Gerät, dass die Automatisierung und die Genauigkeit der Coulter Zählung bei relativ geringen Kosten bietet. </li><li> Das System nutzt die Coulter Prinzip der Impedanz-basierten Teilchennachweis in einem miniaturisierten Format mit einer Kombination aus analogen und digitalen Hardware zur Erfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafische Darstellung. </li><li> Der Einweg-Sensor ist mit einem mikrostrukturierten, Zell-sensing-Zone, dass die Diskriminierung von Zellgröße und Zellvolumen bei sub-Mikrometer-und Sub-Picoliter-Auflösung ermöglicht entwickelt. </li><li> Angereichert mit Präzision Liquid-Handling-Kanäle und Elektronik, das Zepter Zellzähler grafisch Zelle Bevölkerungsstatistik als Histogramm. </li></ol> 2. Erstellung eines Single-Zell-Suspension für Counting <ol><li> So verwenden Sie das Zepter Zellzahl, die durch Verdünnen einer Zellsuspension von Zellen beginnen, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Eine Konzentration von 10,000-500,000 Zellen pro ml ist optimal. </li><li> Transfer 100 ul der verdünnten Zellen zu einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 3. Performing Zellzahlen mit dem Scepter <ol><li> Schalten Sie das Zepter Zellzahl durch Drücken und Halten der Kipphebel an der Rückseite des Gerätes und warten auf die Anweisungen auf dem Bildschirm zu erscheinen. </li><li> Wenn Sie aufgefordert werden, legen einen Sensor, um das Ende der Szepter Einheit mit der Elektrode sensing Panel zugewandten Vorderseite des Gerätes. </li><li> Scepter Sensoren bestehen aus einer präzisionsgepresste Messkammer, mit einem elektronischen Schutzfeld und integrierten Zell-Sensing-Elektroden. Die Sensoren machen es möglich, Zellgröße bei Submikrometerauflösung diskriminieren und Zellvolumen bei sub-Picoliter-Auflösung. </li><li> Konsequente Sensorik, sorgt dafür, dass gleich Probenvolumina gezählt werden und genaue Größe Messungen vorgenommen werden. </li><li> Sobald der Sensor angebracht ist, führen Sie jeden Schritt der Zählvorgang nach den Anweisungen auf dem Bildschirm wie folgt: </li><li> Wenn auf dem Bildschirm liest &quot;Halten Sie den Kolben zu beginnen&quot;, drücken Sie den Kolben. Der Bildschirm wird dann zu lesen &quot;tauchen den Sensor.&quot; Tauchen Sie den Sensor in die Zellsuspension Lösung und lassen Sie die Kolben, um die Zellsuspension in den Sensor absaugen. </li><li> Der Kolben dient als ein elektrisches Signal und wird die Probe plus Totvolumen in den Sensor zu ziehen. Die Geschwindigkeit und Genauigkeit zu stürzen spielt keine Rolle, wie es mit Pipettieren tut. Dieser Prozess wird einige Sekunden dauern. Wenn Sie fertig sind, wird das Instrument Signalton und &quot;Sample geladen&quot; wird auf dem Bildschirm angezeigt werden. </li><li> Nachdem die Probe in den Sensor es durch das Schutzfeld gezogen wird, um Zellgröße und Zellvolumen zu beurteilen, dann durch die Mikrokanäle geladen. Nach 50 ul Probe zählte die Sensor teilt dem Instrument, um aufhören zu zählen. </li><li> Nach der Zählung abgeschlossen ist, wird das Instrument auf den Bildschirm zu lesen &quot;Count Complete. Bitte entfernen Sie Sensor und zu verwerfen.&quot; Befolgen Sie die Eingabeaufforderung, und entfernen und entsorgen Sie den Sensor. </li><li> Das Gerät zeigt dann ein Histogramm der Zellgröße oder Durchmesser auf dem Bildschirm sowie die Zellkonzentration pro mL. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Nach der Zählung abgeschlossen ist und das Histogramm auf dem Instrument angezeigt, gelten Toren, indem Sie die Schaltfläche mit Umschaltfunktion. Wählen Sie &quot;auto Gating&quot; oder &quot;Verwendung letzten&quot; entweder automatisch das Tor auf das Histogramm-Profil basiert, oder bis vor die Tore der letzten Zählung verwenden. </li><li> Unabhängig von der Auswahl, kann das Tor manuell auf die Feinabstimmung der Daten bewegt werden. Drücken Sie die Schaltfläche mit Umschaltfunktion wieder auf der linken Tor markieren und scrollen zuggle das Tor zu bewegen, wie gewünscht. </li><li> Dann drücken Sie die Schaltfläche erneut, um die richtige Tor zu aktivieren und blättern Sie auf die Schaltfläche auf der rechten Tor statt. Klicken Sie erneut auf, eine neue Zellkonzentration, durchschnittliche Zellvolumen und Durchmesser wird angezeigt. </li><li> Das Umschalten kann auch auf beiden Seiten bewegt werden, um die Anzeige zwischen Tag-Schalter, Zeit, mittlere Zellgröße und mittlere Zellvolumen. </li><li> Bis zu 72 Histogramme können auf dem Gerät selbst gespeichert werden. Zum Hochladen der Daten auf einen PC, schließen Sie das Gerät über das USB-Kabel-Anschluss auf dem Bildschirm. </li><li> Auf dem PC, doppelklicken Sie auf das Zepter Software-Anwendung, um die Software starten Sie dann auf &quot;connect&quot;. Alle zählt automatisch in die Software-Port. </li><li> Das Zepter Application Software zeigt das Histogramm detailliert die Verteilung der Bevölkerung der Kultur in entweder Volumen oder Durchmesser. Heruntergeladene Dateien können dann in Microsoft Excel, wo die Rohdaten in Behältern von spezifizierten Zelldurchmesser oder Zellvolumina angezeigt werden exportiert werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Neunzehn verschiedene Zelllinien wurden für die Zählung vorbereitet und theoretische Ausgangspunkt Konzentrationen wurden mit einem Coulter Counter. Diese Zellsuspensionen wurden dann weiter verdünnt, um Zellsuspensionen auf theoretische Zelle Konzentrationen zu erhalten. </li><li> Das Zepter Zellzahl wurde dann zur Zelle Konzentrationen zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt die 5 Verdünnungen, die für 5 repräsentative Zelllinien zusammen mit den theoretischen Zellkonzentration gemessen wurden. </li><li> Die hohe Linearität durch die R2-Werte angegeben, zeigt, dass Scepter das Zählen ist eine zuverlässige Methode für die Zelllinien getestet, über einen weiten linearen Arbeitsbereich. </li><li> Die relative Genauigkeit der Scepter Zählen ist in Abbildung 2, in denen Daten aus Scepter Zählen erhalten mit Zählungen von Coulter Counting verglichen werden aufgezeigt. </li><li> Das Protokoll der Scepter Zellzahl ist gegen den log der Coulter zählt aufgetragen, und zeigt, dass in allen getesteten Zelllinien, match Scepter zählt Coulter zählt. </li><li> Grafen von 19 Zell-Linien wurden mit einem Coulter Counter Z2, das Zepter Zellzahl, eine automatisierte Vision-basierte Zähler wie Vi-Cell oder Unzählige System und eine hemocytemeter. </li><li> Counts wurden nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, unter Verwendung der gleichen Zelle Ausgangs-Suspension und identischen Verdünnungen. Die Ergebnisse in Abbildung 3 dargestellt zeigen, dass die Zellkonzentration von Scepter Zählen ehesten entsprechen theoretischen Zellkonzentrationen mit hoher Linearität gemessen. </li><li> Der prozentuale Variationskoeffizient oder CV, wurde für jede Verdünnung von jeder Zelllinie für jeden Zählsystem berechnet. Abbildung 4 zeigt die durchschnittliche% CVs über 19 Zelllinien, die mit Bezug auf die Zellkonzentration und Zählweise. </li><li> Innerhalb der Reichweite, wird das Zepter Zellzähler genauer als Vision basiert Zählkammer gezählt, die kleinere Standardabweichungen und kleineren mittleren Variationskoeffizienten. </li><li> Scepter Zählen ist zehnmal schneller als hemocytometry und schneller als andere automatisierte Zähler zu. In Abbildung 5, SF9, MCF7 und HEK293-Zellen wurden gezählt unter Verwendung der Methoden in diesem Video beschrieben. </li><li> Die durchschnittliche Zeit für die Zellkonzentration zu messen, wurde aufgezeichnet. Beachten Sie, dass hemocytometry nur einmal wurde pro Probe durchgeführt. </li><li> Scepter macht Messungen an Zellgröße basiert. Dadurch entfallen jegliche Änderungen in der Zellmorphologie kann im Histogramm erfasst werden. Gesunde Kulturen zeigen eine schöne glockenförmige Gauss-Verteilung, während ungesunde Zellen zu lysieren und zu einer Verschiebung in das Histogramm auf der linken Seite (Abb. 6, links). </li><li> Ebenso, wenn eine Bevölkerung von 50% tote Zellen mit 50% lebenden Zellen wurden gemischt, wurden Histogramm Verschiebungen beobachtet (Abbildung 6, rechts). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig7.jpg" alt="Abbildung 7" />

<ol>
	<li>Barghshoon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Counting Survey. , (2009).</li><li>Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+hybridoma+cell+number,+viability,+and+morphology+using+fully+automated+image+analysis.">Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis.</a> Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).</li><li>Houwen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , (2003).</li></ol>

Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sonia Gil, und Grace Johnston von Millipore, die die Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Vergleicht man die Leistung der Scepter Zellzähler den Ergebnissen aus anderen Zählverfahren, folgern wir, dass dieser neue Handheld, automatisierte Zellzähler präzise, ​​schnelle und zuverlässige Zellzahlen liefert über einen weiten Betriebsbereich. Die Funktionalität der Scepter Zählen ist ein Ergebnis der feinmechanischen Technik in die Spitze des Sensors und die ausgefeilte Instrumentierung zählen auf die Coulter-Prinzip verankert. Die Qualität der Leistung schlägt Scepter Zählen als Methode, um die Geschwindigkeit zu erhöhen und zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Zell-basierte Assays. Die Handheld-Format ermöglicht eine schnelle Langeweile freien Zählen direkt an der Zellkultur Kapuze.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Scepter 2,0 Handheld Automated Cell Counter mit 40 um Scepter Sensoren </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20040 </td><td></td></tr><tr><td> Scepter 2,0 Handheld Automated Cell Counter bei 60 pm Scepter Sensoren </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20060 </td><td></td></tr><tr><td> Scepter Sensoren, 60 pm </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC60050 </td><td> Packung mit 50 Stück von Sensoren </td></tr><tr><td> Scepter Sensoren, 40 um </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC40050 </td><td> Packung mit 50 Stück von Sensoren </td></tr><tr><td> Universal Power Adapter </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCPOWER </td><td> </td></tr><tr><td> Scepter O-Ring Kit </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCOCLIP </td><td> 2 O-Ringen und einem Filterdeckel </td></tr></tbody></table>

determining cell number during cell culture using the scepter cell counter

Zählen von Zellen ist häufig eine notwendige, aber lästige Schritt für In-vitro-Zellkultur. Konsequente Zellkonzentrationen sicherzustellen experimentelle Reproduzierbarkeit und Genauigkeit. Die Zellzahlen sind wichtig für die Überwachung der Zelle Gesundheits-und Proliferationsrate, die Beurteilung Immortalisierung oder Transformation, säen die Zellen für nachfolgende Experimente, die Transfektion oder Infektion, und die Vorbereitung für die Zell-basierte Assays. Es ist wichtig, dass Zellzahlen präzise, ​​konsistente und schnell sein, besonders für die quantitative Messung der zellulären Reaktionen. Trotz dieses Bedürfnis nach Schnelligkeit und Genauigkeit in Zellzählung, befragten 71% von 400 Forschern 1, die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer zählen. Während hemocytometry ist billig, es ist mühsam und unter user bias und Missbrauch, die zu ungenauen Ergebnissen zählt. Hemocytometers sind aus optischem Spezialglas, auf dem Zellsuspensionen in bestimmten Mengen verladen werden und gezählt unter dem Mikroskop gemacht. Fehlerquellen in hemocytometry gehören: unebene Zelle in der Probe, zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe, subjektive Entscheidungen, ob eine bestimmte Zelle innerhalb der definierten Zählen Bereich fällt, eine Kontamination der Zählkammer, User-to-User-Variante und Variation der Zählkammer Füllrate 2. Zur Linderung der Langeweile mit manuellen Zählung verbunden sind, zählen 29% der Forscher Zellen mit Hilfe von automatisierten Zellzählung Geräte, dazu gehören Vision-basierte Zähler, Systeme, die Zellen unter Verwendung des Coulter Prinzip erkennen oder Durchflusszytometrie 1. Für die meisten Forscher ist das Haupthindernis für über ein automatisiertes System den Preis mit diesen großen Tischgeräten 1 zugeordnet. Das Zepter cell counter ist ein automatisiertes Handheld-Gerät, dass die Automatisierung und die Genauigkeit der Coulter Zählung bei relativ geringen Kosten bietet. Das System nutzt die Coulter Prinzip der Impedanz-basierten Teilchennachweis 3 in einem miniaturisierten Format mit einer Kombination aus analogen und digitalen Hardware zur Erfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafische Darstellung. Die Einweg-Spitze wird mit einer mikrostrukturierten, Zell-sensing-Zone, dass die Diskriminierung von Zellgröße und Zellvolumen bei sub-Mikrometer-und Sub-Picoliter-Auflösung ermöglicht entwickelt. Angereichert mit Präzision Liquid-Handling-Kanäle und Elektronik, berichtet das Zepter Zellzähler Zellpopulation Statistiken grafisch als Histogramm angezeigt.

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Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Das Zepter Cell Counter ist ein Handheld-Gerät, das automatisierte verwendet, um Zellen zu zählen, überwachen Zelldurchmesser und Volumen, und verwendet, um die Gesundheit und Lebensqualität von Zellpopulationen von einer Kultur zur nächsten Überprüfung werden können.

Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.8K Aufrufe.  Millipore Inc. Das Zepter Cell Counter ist ein Handheld-Gerät, das automatisierte verwendet, um Zellen zu zählen, überwachen Zelldurchmesser und Volumen, und verwendet, um die Gesundheit und Lebensqualität von Zellpopulationen von einer Kultur zur nächsten Überprüfung werden können.

Serie: Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Humane ES-Zellen: Starting Kultur aus eingefrorenen Zellen

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Forschung

Biologie

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Bestimmung der Säugetier-Zellzahlen, Größe der Zellen und Zell Gesundheit Mit dem Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.