Die Mobilität von Krebszellen ist entscheidend für die Einleitung von Metastasen. Daher ist die Untersuchung der Zellbewegung und der invasiven Kapazität von Tumorzellen von großem Interesse. Diese integrierte Methode zur Untersuchung der Migration und Invasion von Krebszellen auf einer einzigen Plattform in Echtzeit bietet eine leicht reproduzierbare und zeiteffiziente Option für das Studium der Zellmobilität und Pathologie.
Diese Methode kann einen Einblick in die Invasion von Krebszellen durch die extrazelluläre Matrix geben und kann auf andere Zelltypen angewendet werden. Um eine optimale Kratzzeit zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die Saatdichte optimiert wurde und verlängern Sie die Inkubationszeit nicht, sobald die Zellmonoschicht 100 Prozent Zusammenfluss erreicht hat. Um die optimale Anzahl der gesäten Zellen für einen Migrationstest zu bestimmen, legen Sie die Zellen in einer Reihe von Dichten in Dreifache in einer 96-Wandplatte.
Platzieren Sie die Platte in den Live-Zellen-Imager, und wählen Sie Planscans aus der Aufgabenliste in der Imager-Software aus. Bestimmen Sie im Schubladen-Setup-Bereich die Positionen der Platte, und klicken Sie auf Behälter hinzufügen, um den Plattentyp auszuwählen. Wählen Oder bearbeiten Sie im Scan-Setup-Bereich das Scanmuster entsprechend dem experimentellen Plattenaufbau, und legen Sie den Scantyp als Standard fest.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitachse, und wählen Sie die festgelegten Intervalle aus. Legen Sie dann "Scans" für 24 Stunden alle'bis zwei Stunden fest, und klicken Sie auf Anwenden. Öffnen Sie nach 24 Stunden die Schublade, damit die Versuchsplatte ausgewählt werden kann, und klicken Sie auf Gefäß entfernen.
Wählen Sie drei bis sechs repräsentative Bilder aus, und platzieren Sie sie in einer neuen Bildsammlung. Um eine ordnungsgemäße Verarbeitungsdefinition zu bestimmen, verwenden Sie Segmentierungsanpassung, Bereinigung und Filter, um eine geeignete Konfluenzmaske anzuwenden, und verwenden Sie vorschau aktuelles all', um die Genauigkeit der Masken anzuzeigen. Starten Sie den Analyseauftrag und bestimmen Sie eine optimierte Zelldichte gemäß einem ungefähren 100-prozentigen Zusammenfluss mit der Zeit innerhalb von sechs bis achtzehn Stunden, je nachdem, wann der Migrationstest beginnt.
Wenden Sie dann das Analysetool für die Zusammenflussverarbeitung auf die hochauflösenden Phasenkontrastbilder an, die automatisch gesammelt werden, um eine Zellproliferationskurve gegen die Zeit zu generieren. Bevor Sie mit dem Test beginnen, beschichten Sie die Platte für den Invasionstest mit 50 Mikroliter extrazellulärem Matrixgel, verdünnt in eiskaltem Zellkulturmedium, auf eine Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter. Legen Sie dann die Platte über Nacht in einen Zellkultur-Inkubator.
Am nächsten Nachmittag das überschüssige Medium sanft ansaugen und die Zellen in der optimierten Dichte in dreifacher Ausgliederung in die entsprechenden Brunnen der extrazellulären Matrix-beschichteten Platte und in eine zusätzliche unbeschichtete 96-Well-Platte plattieren. Dann legen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator über Nacht. Legen Sie am nächsten Morgen die unbeschichtete Migrations-Assayplatte in den Grundplattenhalter des Kratzwerkzeugs und verwenden Sie die Führungsdübel, um die Oberseite des Halters vorsichtig auf die Basis zu legen.
Halten Sie den schwarzen Hebel, während Sie den Stiftblock vorsichtig anheben, um die Kratzer zu machen. Die Kratzer in jedem Brunnen sollten mit bloßem Auge und unter dem Mikroskop sichtbar sein. Dann waschen Sie die Platte ein oder zwei Mal mit vorgewärmtem Kulturmedium, um abgetrennte Zellen oder Zellblätter zu entfernen.
Für den Invasionstest kratzen Sie die beschichtete Platte, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie abgetrennte Zellen und Blätter entfernt haben, verwenden Sie eine vorgekühlte Kühlbox, um die Platte fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius auszueinemn, bevor Sie das kalte Medium sorgfältig ansischen. Als nächstes 50 Mikroliter verdünntes extrazelluläres Matrixgel in die entsprechenden Brunnen geben und die Platte für dreißig Minuten in den Zellkultur-Inkubator legen.
Blasen sind häufig bei der Arbeit mit extrazellulärem Matrixgel, aber sie können durch Diepirating 70 Prozent Ethanol eliminiert werden. Dann fügen Sie 100 Mikroliter frisches, warmes Medium, mit oder ohne Testverbindung, zu den entsprechenden Brunnen der Migrations- oder Invasions-Assay-Platte hinzu und legen Sie die Platte in die Live-Zell-Bildgebungsplattform. Um das Kratzwerkzeug zu reinigen, legen Sie den oberen Stiftblock in einzelne 45-Milliliter-Waschboote, die 5 Prozent Waschmittel eins, ein Prozent Waschmittel zwei, steriles destilliertes Wasser oder 70 Prozent Ethanol für fünf Minuten pro Wäsche enthalten, bevor Sie das Kratzwerkzeug wieder auf die Grundplatte legen, um es in einer staubfreien Umgebung zu lagern.
Für die Abbildung der Wundtests, nachdem die Platte für fünf Minuten ausgeglichen werden konnte, wählen Sie den Gefäßtyp'als Bildprotokollebene aus, und legen Sie den Scantyp als Kratzwunde fest. Wählen oder bearbeiten Sie das Scanmuster entsprechend dem experimentellen Plattenaufbau und planen Sie 24 Stunden wiederholungsschnelles Scannen alle ein bis zwei Stunden für 72 Stunden, oder bis die Wunden wie gezeigt geheilt sind. Wenn alle Wunden verheilt sind, stoppen Sie den Scan und wählen Sie drei bis sechs repräsentative Bilder aus, die eine Reihe von Tonprozentsätzen umfassen, einschließlich Der Bilder direkt nach der Wunde, und den Wundverschluss um 10 und 50 Prozent.
Um eine richtige Verarbeitungsdefinition zu bestimmen, wenden Sie eine geeignete Kratzer-Wundmaske und eine Zusammenflussmaske wie gezeigt an, und verwenden Sie vorschau aktuelles all', um die Genauigkeit der Masken anzuzeigen. Starten Sie dann den Analyseauftrag. Bei einem Migrationstest ist die Wundbreite der durchschnittliche Abstand zwischen den Zellblättern neben der Wunde.
Der Wundzusammenfluss ist der Zusammenfluss innerhalb des verwundeten Bereichs. Der ideale anfängliche Wundzusammenfluss sollte nahe null Prozent liegen. Die relative Wunddichte und der Zusammenfluss der Wunde deuten auf die Geschwindigkeit der Zellen hin, die den Kratzer-Wundbereich einnehmen.
Diese Daten überschneiden sich fast in diesen beiden repräsentativen Zelllinien. Verschiedene Zelllinien zeigen sehr unterschiedliche Wundheilungsfähigkeiten, was auf unterschiedliche Migrationsfähigkeiten zwischen den Zelllinien hinweist. Zum Beispiel werden Lamellipodie n. B. in dieser Brustadenokarzinom-Zelllinie an der Migrationsfront zu Beginn der Migration beobachtet, während diese Mucin-1-produzierende Brustkrebszelllinie keine Anzeichen einer Zellmigration gleichzeitig aufwies.
Weiterhin war die relative Wunddichte der Brustadenokarzinomlinie nach 50 Stunden gesättigt, während sich die relative Wunddichte der Mucin-1-produzierenden Brustkrebszelllinie im Laufe der Zeit nicht änderte, was den hochinvasiven Phänotyp der Adenokarzinomzellen und die Nicht-Invasivität der Mucin 1-produzierenden Brustkrebszellen unterstreicht. Die Adenokarzinomzellen verhielten sich auch anders, während sie durch das extrazelluläre Matrixgel eindrangen, was eine längliche Morphologie mit führenden Vorsprüngen demonstrierte, und bei Migrationstests wurde ein Blödmachen an der Migrationsfront visualisiert. Denken Sie beim Beschichten daran, dass, wenn zu wenige Zellen gesät werden, sich der Kratzer nicht richtig bildet und wenn zu viele Zellen gesät werden, es eine Überbelegung geben wird.
Nach diesem Verfahren können Track-Behandlungen hinzugefügt werden, so dass diese Methode für das Hochdurchsatz-Track-Screening angepasst werden kann. Diese Methode ermöglicht es Forschern, diese Assays auf einer einzigen Plattform durchzuführen, die einen hohen Durchsatz hat, und ermöglicht es Forschern, ihre Zellen in Echtzeit zu überwachen, anstatt in experimentellen Endpunkten. Die Zum Sterilisieren des Kratzwerkzeugs verwendeten Desinfektionsmittel können gefährlich sein.
Stellen Sie sicher, dass Sie die Lösungen gemäß den entsprechenden Sicherheitsdatens asondern und die regulären Triggerlinien Ihrer Einrichtung sammeln und entsorgen.
