Name: Serie: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 27.6K Aufrufe. Harvard University. Die komplette Konstruktion eines eigenen, real-time konfokalen Scanning Imaging-System beschrieben wird. Dieses System, das leicht für Video-rate-Mikroskopie und Mikroendoskopie verwendet werden kann, erlaubt eine Reihe von Imaging-Geometrien und-Anwendungen nicht zugänglich mit handelsüblichen konfokale Systeme, zu einem Bruchteil der Kosten.

Die Autoren bedanken sich bei ThorLabs für ihre Unterstützung dieses Projekts danken. AJN möchte die Unterstützung eines NSF Graduate Fellowship anzuerkennen. Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health durch New Innovator des NIH Director Award Program, gewähren die Nummer 1 DP2 OD007096-01 finanziert. Informationen zu den neuen Innovator Award Program richtet sich an <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Die Autoren bedanken sich bei Tom Hayes für die Nutzung der Harvard Electronics Labor danken.

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Die Produktion dieses Video-Dieses Video wurde von Thorlabs, Inc. gesponsert

Dieses Video-Rate Imaging-System nutzt eine Resonanz galvanometrische Spiegel der bei etwa 8 kHz. Resonant Spiegel kann sehr laut werden, wenn bei voller Leistung laufen, und ihre hohe Tonhöhe kann störend oder gar gefährlich in ausreichender Belichtungszeiten. Obwohl nicht nachgewiesen hier empfiehlt es sich, die Resonanz galvanometrische Spiegel in dem transparenten Gehäuse Schild deutlich zu reduzieren die Lautstärke des Systems und / oder geeignete Gehör Schutzausrüstung, wie Ohrstöpsel zu tragen. Die Resonanz galvanometrische Spiegel Scans in einem sinusförmigen Muster. Allerdings lesen Framegrabber-Karten in Signal der Annahme einer vollständig linearen Sweep-Geschwindigkeit in horizontaler und vertikaler Richtung. Da eine sinusförmige sweep verlangsamt an den Rändern des Scans kann Bildkompression Artefakte entlang der schnellen (horizontal) Bild Achse beobachtet werden. Ein Weg, um dieses Problem zu minimieren, ist absichtlich treiben die Resonanz Galvo Spiegel Reichweite deutlich größer als dieRelais Linsendurchmesser. Dabei werden nur die nahezu lineare zentrale Schwung des Sinus-Scan-Muster verfahren der Probe minimiert Bildverzerrungen. Ein anderer Ansatz wäre, um post-Prozess gesammelten Bildern werden zur schnellen Achse linearisieren. Dies kann durch bildgebende erreicht werden einem bekannten fluoreszierenden Muster (wie ein Gitter) und mit dem bekannten Muster Maße zu einer Verarbeitung Skript, das die gesammelten Bilder unwarps erstellen. Diese besondere Scan-System wurde für die Zwecke der in-vivo-Bildgebung, die oft nur eine aufrechte orientierten Video-rate Mikroskop. Für zelluläres Imaging Experimenten werden inverse Mikroskope mehr typischerweise verwendet. Das Design präsentierte hier kann leicht geändert werden, um eine solche inverse Mikroskop zu bauen, alles, was erforderlich ist eine Drehung der letzten 2 &quot;Durchmesser Spiegel. Statt der Ausrichtung des Spiegels der Abtaststrahl nach unten direkt, kann der Spiegel den Strahl nach oben zu lenken. Platzierung der objektiven Objektivt den gleichen Abstand vom Spiegel zusammen mit einer Probe der Bühne wäre für die Bildgebung in einem invertierten Geometrie ermöglichen. Wenn das Imaging-System wird ausschließlich für mikro Bildgebung gebaut wurden, gibt es keinen Grund, &quot;fold&quot; das Mikroskop Design vertikal überhaupt. Stattdessen kann der gesamte Scan-System auf einer einzigen horizontalen Steckbrett mit dem Objektiv parallel zur optischen Tisch aufgebaut werden. Beachten Sie, dass das Mikroskop in diesem Build eine feste Pinhole-Konfiguration verwendet, während dies sorgt für höchste bauen Einfachheit und Ausrichtung, Nutzern in dem Wunsch ein vielseitiges System könnte prüfen, dass eine variable Blende, wie in den meisten kommerziellen konfokale Mikroskope gefunden werden kann. Indem der Benutzer die Größe der Lochblende für Proben unterschiedlicher Emissionsintensität kompensieren anzupassen, erlaubt dies dem Benutzer eine bessere Optimierung der Kompromiss zwischen Signalstärke und Auflösung für eine bestimmte Probe. Die chOICE von Bild-Faser für das Mikroskop ausgewählt ist wichtig. Wir empfehlen die Verwendung Sumitomo kohärentes Bild Fasern aufgrund ihrer Nähe Faserkern Abstand und geringer relativer Autofluoreszenz. Bild Fasern durch Fujikura hergestellt wurden gefunden, um große Mengen an Autofluoreszenz 10, die schwache Fluoreszenzsignale aus einer Probe zu überwältigen und können den ultimativen Empfindlichkeit des Mikroendoskops haben. Sumitomo hergestellte Fasern, wie zum Beispiel die 8-30N in dieses spezielle Setup verwendet werden, haben viel geringere Autofluoreszenz Ebenen als ihre Fujikura Äquivalente. Während Blutegel Faserbündel könnte als attraktiv für Mikroendoskopie werden, deren Gestaltung in der Regel Orte einzelnen Faserkerne zu weit auseinander, so dass die Faserkerne dünn Probe Objekte aus verlassen bedeutenden Regionen von potentiellem Interesse. Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass, während das Mikroskop hier beschriebenen werden in eine Vielzahl von nützlichen in vitro und in vivo applicati werdenons und für einen Bruchteil der Kosten einer voll ausgestatteten kommerzielles System geschaffen werden kann, muss es nicht Funktionen wie Durchlicht-Erkennung, ein Okular zur Betrachtung oder einen Strahlengang für nicht-konfokalen Weitfeld Epifluoreszenz. Während es möglich ist, ein System mit diesen Features von Grund auf neu konstruieren, darf der Leser in dem Wunsch ein solches System wollen ein bestehendes kommerzielles System, um ihre Bedürfnisse zu erfüllen, anstatt zu initiieren eine ganz neue bauen zu ändern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Part Name </td><td> Hersteller </td><td> Artikelnummer </td><td> Technische Daten </td><td> Menge </td></tr><tr><td> 515 nm Bandpass Filter </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 25,4 mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 25,4 mm Dia. x 76,2 mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 25,4 mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz R High Frequency Optical Scanner </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGC-Treiber </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA Fotosensor Module </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Strombegrenzung empfohlen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Power Supply </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Für die Verwendung mit H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS Ziel </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios eA / XA Framegrabber-Karte </td><td> Matrox </td><td> Solios eA / XA </td><td> MIL-Software erforderlich; OEM-Verbindungen empfohlen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 12V Netzteil </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8,5 A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5x Mikroskopobjektivs </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, 25,4 mm Brennweite </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Coherent Bild Fiber </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 Cap Screw und Hardware Kit </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 pm Mounted Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td> Ideal für den Bau räumliche Filter </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Cage Clamp Cube </td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Cage System Cube, 4-Way </td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Faseranschluss Laser Diode, FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Produkt veraltet; durch LP405-SF10 ersetzt </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5-Minuten Epoxy, 1 Unze </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 Achsen Kinematische Optikhalter </td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Cap Screw und Hardware Kit </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Stellschraube und Hardware Kit </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adapter mit externem RMS Themen und interne SM1 Themen </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. FC / PC und FC / APC Collimator, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> ThorLabs </td><td> CFC-2X-A </td><td> f = 2,0 mm </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Einstellbare Faserkollimator Adapter, SM1 Threaded </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Aluminum Breadboard, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 Gewinde </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Benchtop Laser Diode / TEC-Controller </td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm Long-Pass Dichroitische Spiegel </td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kinematische Halterung für Ø1 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC Halterung für ThorLabs Fiber-Pigtailed Laserdioden </td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Objektivanschluss für Ø18 mm Optik </td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td> Ein Sicherungsring enthalten </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Linsenhalter für 2 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td> Mit internen und externen Threading; Haltering enthalten </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Series Cage Assembly Rod, 6 &quot;Long, Ø 4 mm, Anz. 1 </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Pedestal Pillar Beitrag, 8-32 Taps, 1&quot; Long </td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Beitrag Extension, Länge = 0,5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Beitrag Extension, Länge = 0,75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm dick </td><td> ThorLabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 Rotating Einstellbare Fokussierung Element, L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm dick </td><td> ThorLabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 um Mounted Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris Low Drift Ø1 &quot;Kinematische Spiegelhalter </td><td> ThorLabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Low Drift </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 Tubus, L = 1 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Ein Sicherungsring enthalten </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 Gewinde 30 mm Cage Plate, 0,35 &quot;Thick </td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 bis M25 Optical Component Threading-Adapter </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td> Externe SM1 Themen und interne M25.5x0.5 Themen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kleine Breite Diameter Galvo-System </td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kleine Befestigungsklemme </td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;versenkte Slot, universal </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Spatial-Filter-System </td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole separat erhältlich </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-gekühlte Berg für 5,6 und 9 mm Laser </td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Vertikale Halterung für Breadboards </td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td> Jeder </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

Die konfokale Mikroskopie hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Biologie und der Biomedizin und ermöglicht eine schnelle, hohe Empfindlichkeit und hohe Auflösung optische Schnitte von komplexen Systemen. Die konfokale Mikroskopie wird routinemäßig eingesetzt, zum Beispiel auf bestimmte zelluläre Ziele 1, Monitor Dynamik in lebenden Zellen 2-4 studieren, und visualisieren die dreidimensionale Entwicklung ganzer Organismen 5,6. Erweiterungen der konfokalen Imaging-Systeme, wie die konfokale Mikroendoskopen, für die hochauflösende Bildgebung in vivo 7 zu ermöglichen und werden derzeit für Krankheiten Bildgebung und Diagnostik im klinischen Umfeld 8,9 angewendet. Die konfokale Mikroskopie bietet dreidimensionale Auflösung durch die Schaffung von so genannten &quot;optischen Schnitten&quot; mit einfachen geometrischen Optik. In einem Standard-wide-field-Mikroskop wird die Fluoreszenz aus einer Probe erzeugt durch ein Objektiv gesammelt und weitergeleitet direkt auf einen Detektor. Während akzeptierenkönnen für die Bildgebung dünnen Proben, zu dicken Proben durch Fluoreszenz oberhalb und unterhalb der Objektivbrennebene generiert verwischt. Im Gegensatz dazu ermöglicht die konfokale Mikroskopie virtuelle optische Schnitte von Proben, die Ablehnung out-of-focus Licht hochauflösende dreidimensionale Darstellungen von Proben zu bauen. Konfokalen Mikroskopen erreichen dieses Kunststück mit einem konfokalen Blende im Detektionsstrahlengang. Die Fluoreszenz von einer Probe durch das Ziel erhoben wird wieder durch den Scan-Spiegel und durch die primäre dichroitische Spiegel, ein Spiegel sorgfältig ausgewählt, um kürzere Wellenlängen wie die Laser-Anregungsstrahl reflektieren, während das Bestehen der länger Stokes-verschobene Fluoreszenzemission weitergeleitet. Diese langwellige Fluoreszenz-Signal wird dann an ein Paar Linsen auf beiden Seiten einer Lochkamera, die in einer Ebene exakt Konjugat mit der Brennebene des Objektivs positioniert ist vergangen. Photonen aus dem fokalen Volumen des Objekts gesammelt werden gebündeltdurch das Objektiv und werden durch das konfokale Linsen durch die Lochblende fokussiert. Fluoreszenz oberhalb oder unterhalb der Brennebene erzeugt wird daher nicht korrekt kollimiert werden, und wird nicht durch das konfokale Pinhole 1 Pass, die Schaffung einer optischen Abschnitt, in dem nur Licht aus dem Mikroskop Fokus sichtbar ist. (Abb. 1). So ist die Lochkamera effektiv wirkt wie ein virtueller Blende in der Brennebene, die Beschränkung des erkannten Emission nur einen begrenzten räumlichen Lage. Moderne kommerzielle konfokalen Mikroskopen bieten dem Anwender den vollautomatischen Betrieb, so dass ehemals komplexe bildgebende Verfahren relativ einfach und zugänglich. Trotz der Flexibilität und Leistungsfähigkeit dieser Systeme sind kommerzielle konfokalen Mikroskopen nicht gut für alle konfokalen Imaging-Aufgaben, wie viele in vivo Imaging-Anwendungen geeignet. Ohne die Fähigkeit, maßgeschneiderte Imaging-Systeme zu schaffen, um ihre Bedürfnisse zu erfüllen, können wichtige Experimente bleiben in der Reaktionh für viele Wissenschaftler. In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode für die komplette Konstruktion eines eigenen, Video-rate konfokalen Imaging-System von Grundkomponenten. Die aufrechte Mikroskop wird unter Verwendung eines resonanten Galvanometer Spiegel, um die schnelle Scan-Achse zu schaffen, während ein Standard-Geschwindigkeit resonant galvanometrische Spiegel der langsamen Achsen-Scan werden. So erstellen Sie eine genaue abgelenkten Strahl in das Objektiv zu konzentrieren, wird dieser Spiegel bei den sogenannten telezentrischen Flugzeuge mit vier Relais-Linsen positioniert werden. Konfokalen Detektion wird durch die Verwendung einer Standard-, Off-the-shelf Photomultiplier (PMT) werden, und die Bilder werden erfasst und angezeigt werden mit einem Matrox Framegrabber-Karte und der mitgelieferten Software.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Die komplette Konstruktion eines eigenen, real-time konfokalen Scanning Imaging-System beschrieben wird. Dieses System, das leicht für Video-rate-Mikroskopie und Mikroendoskopie verwendet werden kann, erlaubt eine Reihe von Imaging-Geometrien und-Anwendungen nicht zugänglich mit handelsüblichen konfokale Systeme, zu einem Bruchteil der Kosten.

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

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