Name: Serie: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 27.7K Aufrufe. Harvard University. Die komplette Konstruktion eines eigenen, real-time konfokalen Scanning Imaging-System beschrieben wird. Dieses System, das leicht für Video-rate-Mikroskopie und Mikroendoskopie verwendet werden kann, erlaubt eine Reihe von Imaging-Geometrien und-Anwendungen nicht zugänglich mit handelsüblichen konfokale Systeme, zu einem Bruchteil der Kosten.

Die Autoren bedanken sich bei ThorLabs für ihre Unterstützung dieses Projekts danken. AJN möchte die Unterstützung eines NSF Graduate Fellowship anzuerkennen. Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health durch New Innovator des NIH Director Award Program, gewähren die Nummer 1 DP2 OD007096-01 finanziert. Informationen zu den neuen Innovator Award Program richtet sich an <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Die Autoren bedanken sich bei Tom Hayes für die Nutzung der Harvard Electronics Labor danken.

<ol>
	<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 985-985 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li><li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics.">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li><li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging.">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li><li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration.">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation.">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li><li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+(Cell-viZio)+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation.">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li><li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+confocal+laser+endomicroscopy.">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li><li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy.">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li><li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li></ol>

Die Produktion dieses Video-Dieses Video wurde von Thorlabs, Inc. gesponsert

Dieses Video-Rate Imaging-System nutzt eine Resonanz galvanometrische Spiegel der bei etwa 8 kHz. Resonant Spiegel kann sehr laut werden, wenn bei voller Leistung laufen, und ihre hohe Tonhöhe kann störend oder gar gefährlich in ausreichender Belichtungszeiten. Obwohl nicht nachgewiesen hier empfiehlt es sich, die Resonanz galvanometrische Spiegel in dem transparenten Gehäuse Schild deutlich zu reduzieren die Lautstärke des Systems und / oder geeignete Gehör Schutzausrüstung, wie Ohrstöpsel zu tragen. Die Resonanz galvanometrische Spiegel Scans in einem sinusförmigen Muster. Allerdings lesen Framegrabber-Karten in Signal der Annahme einer vollständig linearen Sweep-Geschwindigkeit in horizontaler und vertikaler Richtung. Da eine sinusförmige sweep verlangsamt an den Rändern des Scans kann Bildkompression Artefakte entlang der schnellen (horizontal) Bild Achse beobachtet werden. Ein Weg, um dieses Problem zu minimieren, ist absichtlich treiben die Resonanz Galvo Spiegel Reichweite deutlich größer als dieRelais Linsendurchmesser. Dabei werden nur die nahezu lineare zentrale Schwung des Sinus-Scan-Muster verfahren der Probe minimiert Bildverzerrungen. Ein anderer Ansatz wäre, um post-Prozess gesammelten Bildern werden zur schnellen Achse linearisieren. Dies kann durch bildgebende erreicht werden einem bekannten fluoreszierenden Muster (wie ein Gitter) und mit dem bekannten Muster Maße zu einer Verarbeitung Skript, das die gesammelten Bilder unwarps erstellen. Diese besondere Scan-System wurde für die Zwecke der in-vivo-Bildgebung, die oft nur eine aufrechte orientierten Video-rate Mikroskop. Für zelluläres Imaging Experimenten werden inverse Mikroskope mehr typischerweise verwendet. Das Design präsentierte hier kann leicht geändert werden, um eine solche inverse Mikroskop zu bauen, alles, was erforderlich ist eine Drehung der letzten 2 &quot;Durchmesser Spiegel. Statt der Ausrichtung des Spiegels der Abtaststrahl nach unten direkt, kann der Spiegel den Strahl nach oben zu lenken. Platzierung der objektiven Objektivt den gleichen Abstand vom Spiegel zusammen mit einer Probe der Bühne wäre für die Bildgebung in einem invertierten Geometrie ermöglichen. Wenn das Imaging-System wird ausschließlich für mikro Bildgebung gebaut wurden, gibt es keinen Grund, &quot;fold&quot; das Mikroskop Design vertikal überhaupt. Stattdessen kann der gesamte Scan-System auf einer einzigen horizontalen Steckbrett mit dem Objektiv parallel zur optischen Tisch aufgebaut werden. Beachten Sie, dass das Mikroskop in diesem Build eine feste Pinhole-Konfiguration verwendet, während dies sorgt für höchste bauen Einfachheit und Ausrichtung, Nutzern in dem Wunsch ein vielseitiges System könnte prüfen, dass eine variable Blende, wie in den meisten kommerziellen konfokale Mikroskope gefunden werden kann. Indem der Benutzer die Größe der Lochblende für Proben unterschiedlicher Emissionsintensität kompensieren anzupassen, erlaubt dies dem Benutzer eine bessere Optimierung der Kompromiss zwischen Signalstärke und Auflösung für eine bestimmte Probe. Die chOICE von Bild-Faser für das Mikroskop ausgewählt ist wichtig. Wir empfehlen die Verwendung Sumitomo kohärentes Bild Fasern aufgrund ihrer Nähe Faserkern Abstand und geringer relativer Autofluoreszenz. Bild Fasern durch Fujikura hergestellt wurden gefunden, um große Mengen an Autofluoreszenz 10, die schwache Fluoreszenzsignale aus einer Probe zu überwältigen und können den ultimativen Empfindlichkeit des Mikroendoskops haben. Sumitomo hergestellte Fasern, wie zum Beispiel die 8-30N in dieses spezielle Setup verwendet werden, haben viel geringere Autofluoreszenz Ebenen als ihre Fujikura Äquivalente. Während Blutegel Faserbündel könnte als attraktiv für Mikroendoskopie werden, deren Gestaltung in der Regel Orte einzelnen Faserkerne zu weit auseinander, so dass die Faserkerne dünn Probe Objekte aus verlassen bedeutenden Regionen von potentiellem Interesse. Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass, während das Mikroskop hier beschriebenen werden in eine Vielzahl von nützlichen in vitro und in vivo applicati werdenons und für einen Bruchteil der Kosten einer voll ausgestatteten kommerzielles System geschaffen werden kann, muss es nicht Funktionen wie Durchlicht-Erkennung, ein Okular zur Betrachtung oder einen Strahlengang für nicht-konfokalen Weitfeld Epifluoreszenz. Während es möglich ist, ein System mit diesen Features von Grund auf neu konstruieren, darf der Leser in dem Wunsch ein solches System wollen ein bestehendes kommerzielles System, um ihre Bedürfnisse zu erfüllen, anstatt zu initiieren eine ganz neue bauen zu ändern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Part Name </td><td> Hersteller </td><td> Artikelnummer </td><td> Technische Daten </td><td> Menge </td></tr><tr><td> 515 nm Bandpass Filter </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 25,4 mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 25,4 mm Dia. x 76,2 mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 25,4 mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Objektiv 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz R High Frequency Optical Scanner </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGC-Treiber </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA Fotosensor Module </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Strombegrenzung empfohlen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Power Supply </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Für die Verwendung mit H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS Ziel </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios eA / XA Framegrabber-Karte </td><td> Matrox </td><td> Solios eA / XA </td><td> MIL-Software erforderlich; OEM-Verbindungen empfohlen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 12V Netzteil </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8,5 A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5x Mikroskopobjektivs </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, 25,4 mm Brennweite </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Coherent Bild Fiber </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 Cap Screw und Hardware Kit </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 pm Mounted Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td> Ideal für den Bau räumliche Filter </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Cage Clamp Cube </td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Cage System Cube, 4-Way </td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Faseranschluss Laser Diode, FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Produkt veraltet; durch LP405-SF10 ersetzt </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5-Minuten Epoxy, 1 Unze </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 Achsen Kinematische Optikhalter </td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Cap Screw und Hardware Kit </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Stellschraube und Hardware Kit </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adapter mit externem RMS Themen und interne SM1 Themen </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. FC / PC und FC / APC Collimator, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> ThorLabs </td><td> CFC-2X-A </td><td> f = 2,0 mm </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Einstellbare Faserkollimator Adapter, SM1 Threaded </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Aluminum Breadboard, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 Gewinde </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Benchtop Laser Diode / TEC-Controller </td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm Long-Pass Dichroitische Spiegel </td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kinematische Halterung für Ø1 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC Halterung für ThorLabs Fiber-Pigtailed Laserdioden </td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Objektivanschluss für Ø18 mm Optik </td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td> Ein Sicherungsring enthalten </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Linsenhalter für 2 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td> Mit internen und externen Threading; Haltering enthalten </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Series Cage Assembly Rod, 6 &quot;Long, Ø 4 mm, Anz. 1 </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Pedestal Pillar Beitrag, 8-32 Taps, 1&quot; Long </td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Beitrag Extension, Länge = 0,5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Beitrag Extension, Länge = 0,75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm dick </td><td> ThorLabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 Rotating Einstellbare Fokussierung Element, L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm dick </td><td> ThorLabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 um Mounted Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris Low Drift Ø1 &quot;Kinematische Spiegelhalter </td><td> ThorLabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Low Drift </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 Tubus, L = 1 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Ein Sicherungsring enthalten </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 Gewinde 30 mm Cage Plate, 0,35 &quot;Thick </td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 bis M25 Optical Component Threading-Adapter </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td> Externe SM1 Themen und interne M25.5x0.5 Themen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kleine Breite Diameter Galvo-System </td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kleine Befestigungsklemme </td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;versenkte Slot, universal </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Spatial-Filter-System </td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole separat erhältlich </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-gekühlte Berg für 5,6 und 9 mm Laser </td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Vertikale Halterung für Breadboards </td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td> Jeder </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

Die konfokale Mikroskopie hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Biologie und der Biomedizin und ermöglicht eine schnelle, hohe Empfindlichkeit und hohe Auflösung optische Schnitte von komplexen Systemen. Die konfokale Mikroskopie wird routinemäßig eingesetzt, zum Beispiel auf bestimmte zelluläre Ziele 1, Monitor Dynamik in lebenden Zellen 2-4 studieren, und visualisieren die dreidimensionale Entwicklung ganzer Organismen 5,6. Erweiterungen der konfokalen Imaging-Systeme, wie die konfokale Mikroendoskopen, für die hochauflösende Bildgebung in vivo 7 zu ermöglichen und werden derzeit für Krankheiten Bildgebung und Diagnostik im klinischen Umfeld 8,9 angewendet. Die konfokale Mikroskopie bietet dreidimensionale Auflösung durch die Schaffung von so genannten &quot;optischen Schnitten&quot; mit einfachen geometrischen Optik. In einem Standard-wide-field-Mikroskop wird die Fluoreszenz aus einer Probe erzeugt durch ein Objektiv gesammelt und weitergeleitet direkt auf einen Detektor. Während akzeptierenkönnen für die Bildgebung dünnen Proben, zu dicken Proben durch Fluoreszenz oberhalb und unterhalb der Objektivbrennebene generiert verwischt. Im Gegensatz dazu ermöglicht die konfokale Mikroskopie virtuelle optische Schnitte von Proben, die Ablehnung out-of-focus Licht hochauflösende dreidimensionale Darstellungen von Proben zu bauen. Konfokalen Mikroskopen erreichen dieses Kunststück mit einem konfokalen Blende im Detektionsstrahlengang. Die Fluoreszenz von einer Probe durch das Ziel erhoben wird wieder durch den Scan-Spiegel und durch die primäre dichroitische Spiegel, ein Spiegel sorgfältig ausgewählt, um kürzere Wellenlängen wie die Laser-Anregungsstrahl reflektieren, während das Bestehen der länger Stokes-verschobene Fluoreszenzemission weitergeleitet. Diese langwellige Fluoreszenz-Signal wird dann an ein Paar Linsen auf beiden Seiten einer Lochkamera, die in einer Ebene exakt Konjugat mit der Brennebene des Objektivs positioniert ist vergangen. Photonen aus dem fokalen Volumen des Objekts gesammelt werden gebündeltdurch das Objektiv und werden durch das konfokale Linsen durch die Lochblende fokussiert. Fluoreszenz oberhalb oder unterhalb der Brennebene erzeugt wird daher nicht korrekt kollimiert werden, und wird nicht durch das konfokale Pinhole 1 Pass, die Schaffung einer optischen Abschnitt, in dem nur Licht aus dem Mikroskop Fokus sichtbar ist. (Abb. 1). So ist die Lochkamera effektiv wirkt wie ein virtueller Blende in der Brennebene, die Beschränkung des erkannten Emission nur einen begrenzten räumlichen Lage. Moderne kommerzielle konfokalen Mikroskopen bieten dem Anwender den vollautomatischen Betrieb, so dass ehemals komplexe bildgebende Verfahren relativ einfach und zugänglich. Trotz der Flexibilität und Leistungsfähigkeit dieser Systeme sind kommerzielle konfokalen Mikroskopen nicht gut für alle konfokalen Imaging-Aufgaben, wie viele in vivo Imaging-Anwendungen geeignet. Ohne die Fähigkeit, maßgeschneiderte Imaging-Systeme zu schaffen, um ihre Bedürfnisse zu erfüllen, können wichtige Experimente bleiben in der Reaktionh für viele Wissenschaftler. In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode für die komplette Konstruktion eines eigenen, Video-rate konfokalen Imaging-System von Grundkomponenten. Die aufrechte Mikroskop wird unter Verwendung eines resonanten Galvanometer Spiegel, um die schnelle Scan-Achse zu schaffen, während ein Standard-Geschwindigkeit resonant galvanometrische Spiegel der langsamen Achsen-Scan werden. So erstellen Sie eine genaue abgelenkten Strahl in das Objektiv zu konzentrieren, wird dieser Spiegel bei den sogenannten telezentrischen Flugzeuge mit vier Relais-Linsen positioniert werden. Konfokalen Detektion wird durch die Verwendung einer Standard-, Off-the-shelf Photomultiplier (PMT) werden, und die Bilder werden erfasst und angezeigt werden mit einem Matrox Framegrabber-Karte und der mitgelieferten Software.

Watch this Scientific Journal Video about Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy at JoVE.com

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Die komplette Konstruktion eines eigenen, real-time konfokalen Scanning Imaging-System beschrieben wird. Dieses System, das leicht für Video-rate-Mikroskopie und Mikroendoskopie verwendet werden kann, erlaubt eine Reihe von Imaging-Geometrien und-Anwendungen nicht zugänglich mit handelsüblichen konfokale Systeme, zu einem Bruchteil der Kosten.

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

video-rate-scanning-confocal-microscopy-and-microendoscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.7K Aufrufe.  Harvard University. Die komplette Konstruktion eines eigenen, real-time konfokalen Scanning Imaging-System beschrieben wird. Dieses System, das leicht für Video-rate-Mikroskopie und Mikroendoskopie verwendet werden kann, erlaubt eine Reihe von Imaging-Geometrien und-Anwendungen nicht zugänglich mit handelsüblichen konfokale Systeme, zu einem Bruchteil der Kosten.

Serie: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; Gewebeanalyse

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big challenge with the state-of-the-art retinal imaging modalities because they would require z-stacking to compile a volumetric dataset. Newer optical coherence tomography (OCT) and OCT angiography (OCTA) systems overcome these restrictions to provide three-dimensional (3D) anatomical and vascular images, but the dye-free nature of OCT cannot visualize leakage indicative of vascular dysfunction. This protocol describes a novel oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO) technique that provides 3D volumetric fluorescence retinal imaging. The setup of the imaging system generates the oblique scanning by a dove tail slider and aligns the final imaging system at an angle to detect fluorescent cross-sectional images. The system uses the laser scanning method, and therefore, allows an easy incorporation of OCT as a complementary volumetric structural imaging modality. In vivo imaging on rat retina is demonstrated here. Fluorescein solution is intravenously injected to produce volumetric fluorescein angiography (vFA).

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Here, we present a protocol to get a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence and OCT retinal image by using a novel imaging multimodal platform. We will introduce the system setup, the method of alignment, and the operational protocols. In vivo imaging will be demonstrated, and representative results will be provided.

Multimodale Volumetrische Retinal Imaging von schrägen Scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) und optische Kohärenztomografie (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

Nahezu simultanes Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) auf lebenden Zellen

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...