Die Autoren danken den Mitgliedern des FDA Microbiology Methods Validation Subcommittee (MMVS) und des Bacteriological Analytical Manual (BAM) Council für die kritische Überprüfung von Salmonella LAMP-Methodenvalidierungsstudien.

<ol>
	<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).</li><li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances.">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications.">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li><li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template.">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li><li>Zhang, X., Lowe, S. 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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Die in diesem Manuskript zum Ausdruck gebrachten Ansichten sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die offizielle Politik des Department of Health and Human Services, der U.S. Food and Drug Administration oder der US-Regierung wider. Die Bezugnahme auf kommerzielle Materialien, Ausrüstungen oder Verfahren stellt in keiner Weise eine Genehmigung, Billigung oder Empfehlung der Food and Drug Administration dar.

Wir haben hier eine einfache, schnelle, spezifische und empfindliche LAMP-Methode zum Screening und zur Bestätigung von Salmonellen in Tierfutter bzw. reiner Kultur vorgestellt. Mit dem Komfort eines isothermen Master-Mix, der vier Schlüsselreagenzien und einen gebrauchsfertigen, hausinternen Primer-Mix enthält, erfordert die Montage einer LAMP-Reaktion nur wenige Pipettierschritte(Abbildung 1). Die Gesamtlaufzeit einschließlich Amplifikation und Annealphase beträgt weniger als 38 min(Abbildung 2A,B und Abbildung 3A,B). Positive Ergebnisse werden über Echtzeitfluoreszenz überwacht (Abbildung 2C und Abbildung 3C,D) und können bereits in 5 min26nachgewiesen werden. Die Nealphase dient als zusätzliche Bestätigung der LAMP-Spezifität, da nur Proben mit korrektem Tm (ca. 90 °C) als positiv gemeldet werden(Abbildung 2D,E und Abbildung 3E-G). Empfindlichkeiten von 1 Salmonellenzelle in Reinkultur und < 1 KBE/25 g in Tierfutter wurden bereits26berichtet.
Da LAMP sehr effektiv ist und eine große Menge an DNA1erzeugt, ist es wichtig, dass die besten Laborpraktiken verwendet werden, um Kreuzkontaminationen zu verhindern, die die Bereiche für die Vorbereitung des LAMP-Master-Mix physisch trennen und DNA-Vorlagen hinzufügen können, die Erzeugung von Aerosolen zu vermeiden, Filterpipettenspitzen zu verwenden, Handschuhe häufig zu wechseln und auf das Öffnen von LAMP-Reaktionsröhren nach der Amplifikation zu verzichten.
Die Spezifität dieser Salmonella LAMP-Methode wurde zuvor mit 300 Bakterienstämmen (247 Salmonellen von 185 Serovars und 53 Nicht-Salmonellen) getestet und nachweislich 100% spezifisch26. Insbesondere wurden signifikante Unterschiede in Tmax zwischen den beiden Salmonellenarten S. enterica und Salmonella bongoriund zwischen s. enterica Subspecies, insbesondere subsp. arizonae (IIIa)26beobachtet. Dennoch waren dies nach wie vor gültige positive Ergebnisse nach den Regeln für die Interpretation der LAMP-Ergebnisse. In unserer multilaborativen kollaborativen Studie in trockener Hundenahrung, an der 14 Analytiker19beteiligt waren, wurden gelegentlich Proben mit inkonsistenten Ergebnissen in doppelten LAMP-Läufen beobachtet. In der Regel handelte es sich um Proben mit verzögerten positiven Ergebnissen (Tmax > 15 min). Wiederholte beide Läufe unabhängig voneinander löste das Problem in der Regel. Seltener beobachteten wir Proben mit korrekten Tm, aber keine oder unregelmäßige Tmax Werte (< 5 min). Dies wurde in der Regel durch Luftblasen im Reaktionsrohr verursacht.
Während des gesamten Lebenszyklus der Entwicklung, Evaluierung, Präkollaborativen Studie und Multilaborierung von LAMP haben wir eine hohe Toleranz von LAMP gegenüber Inhibitoren in verschiedenen Tiernahrungs- oder Lebensmittelmatrizen und Kulturmedien4,19,22,23,24beobachtet, die die Robustheit der Methode hervorhebt und zahlreiche andere Studien auf globaler Ebene8kooperiert. Dies ist besser als PCR oder Echtzeit-PCR, die in der Regel eine interne Verstärkungskontrolle erfordert, um sicherzustellen, dass negative Ergebnisse nicht auf Matrix-Hemmung28zurückzuführen sind. Darüber hinaus zeigte LAMP in der überwiegenden Mehrheit der Studien eine ähnliche (oder überlegene) Spezifität und Empfindlichkeit im Vergleich zu PCR oder Echtzeit-PCR in der überwiegenden Mehrheit der Studien8. Die Kosten für LAMP-Reagenzien belaufen sich auf ca. 1 USD pro Reaktion. Die in diesem Protokoll verwendeten LAMP-Instrumente sind klein, wartungsarm und tragbar. Sie können jede isotherme Amplifikationsmethode handhaben, die die Zieldetektion durch Fluoreszenzmessung verwendet, LAMP inklusive. Mit der LAMP-Software können umfassende Berichte in mehreren Formaten (pdf, Text und Bild) generiert werden.
Die Methodenvalidierung ist ein wichtiger Schritt, bevor eine neue Methode für die Routineanwendung übernommen werden kann. Bemerkenswert ist, dass das hier gemeldete LAMP-Protokoll die Multilabor-Validierung erfolgreich abgeschlossen hat19. Mit der kürzlicherfolgten Aufnahme dieses LAMP-Protokolls in das BAM Chapter 5 Salmonella27der US-amerikanischen FDA wird erwartet, dass die Methode viel breiter genutzt wird, sowohl als Schnellscreening-Methode in Tiernahrung als auch als zuverlässige Bestätigungsmethode für mutmaßliche Salmonellenisolate aus allen Lebensmittelkategorien.

Loop-mediale isotherme Amplifikation (LAMP) ist ein neuartiger isothermaler Nukleinsäure-Amplifikationstest (iNAAT), der im Jahr 2000 von einer Gruppe japanischer Wissenschaftler erfunden wurde1. Durch die Bildung einer zielspezifischen Stammschleifen-DNA-Struktur in den ersten Schritten verwendet LAMP eine Strang-verdrängende DNA-Polymerase, um dieses Ausgangsmaterial quasi-exponentiell effizient zu verstärken, was zu 109 Kopien des Ziels in weniger als 1 h1führt. Im Vergleich zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einem weit verbreiteten NAAT, hat LAMP mehrere Vorteile. Zunächst werden LAMP-Reaktionen unter isothermen Bedingungen durchgeführt. Dies ermuntert die Notwendigkeit eines ausgeklügelten thermischen Fahrradinstruments. Zweitens ist LAMP sehr tolerant gegenüber Kulturmedien und biologischen Substanzen2 mit Robustheit, die sowohl für klinische als auch für Lebensmittelanwendungen nachgewiesen wird3,4. Dies vereinfacht die Probenvorbereitung und minimiert falsche negative Ergebnisse5. Drittens ist LAMP für mehrere Detektionsplattformen wie Trübung, Colorimetrie, Biolumineszenz, Fluoreszenz und Mikrofluidik6zugänglich. Viertens ist LAMP sehr spezifisch, da es vier bis sechs speziell entwickelte Primer verwendet, um sechs bis acht spezifische Regionen1,7anzuvisieren. Fünftens ist LAMP ultrasensibel und zahlreiche Studien haben seine überlegene Empfindlichkeit gegenüber PCR oder Echtzeit-PCR8berichtet. Schließlich ist LAMP schneller mit vielen Assays, die jetzt eine Standardlaufzeit von 30 min anwenden, während PCR-Assays in der Regel 1-2 h8dauern.
Diese attraktiven Eigenschaften befeuerten die Anwendung von LAMP in breiten Bereichen der Pathogenerkennung, einschließlich der In-vitro-Diagnostik 9, der Tierseuchendiagnostik10und der Lebensmittel- und Umwelttests11. Insbesondere wurde eine TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis) von der WHO als gültiger Ersatztest für die Sputum-Abstrichmikroskopie für Lungentuberkulose-Diagnosen in peripheren Umgebungen empfohlen12. Die LAMP-Anwendung erstreckt sich auch über die mikrobielle Identifizierung hinaus und umfasst den Nachweis von Allergenen, Tierarten, Arzneimittelresistenzen, genetisch veränderten Organismen und Pestiziden13.
Nontyphoidal Salmonella ist ein zoonotischer Erreger von erheblichem Lebensmittelsicherheit und öffentlicher Gesundheit weltweit14. Es wurde auch als eine wichtige mikrobielle Gefahr in Lebensmitteln für Tiere (d. h. Tierfutter)15,16identifiziert. Um Salmonellenkrankheiten/Ausbrüche durch kontaminierte menschliche und tierische Lebensmittel zu verhindern, ist es unerlässlich, schnelle, zuverlässige und robuste Methoden zur Prüfung von Salmonellen in einer Vielzahl von Matrizen zu haben. In den letzten zehn Jahren wurden international erhebliche Anstrengungen zur Entwicklung und Anwendung von Salmonella LAMP-Assays in einer breiten Palette von Lebensmittelmatrizen unternommen, wie kürzlich in einem ausführlichenBerichtzusammengefasst 8 . Mehrere Salmonella LAMP-Assays, darunter die hier vorgestellte, haben die Multilabor-Validierung nach etablierten internationalen Richtlinien17,18,19,20erfolgreich abgeschlossen.
Unser Salmonella LAMP-Test zielt speziell auf das Salmonella-Invasionsgen invA (GenBank-Beitrittsnummer M90846)21 ab und ist schnell, zuverlässig und robust in mehreren Lebensmittelmatrizen4,22,23,24,25,26. Die Methode wurde in sechs Tiernahrungsmatrizen in einer vorgemeinschaftlichen Studie26 und in trockener Hundefutter in einer Multilabor-Kollaborationsstudie19validiert. Infolgedessen wurde die hier vorgestellte Salmonella LAMP-Methode kürzlich in das Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 Salmonella27 der U.S. Food and Drug Administration (FDA) aufgenommen, um zwei Zwecken zu dienen, eine als Schnellscreening-Methode für das Vorhandensein von Salmonellen in Tiernahrung und zwei als zuverlässige Bestätigungsmethode für mutmaßliche Salmonellen, die aus allen Lebensmitteln isoliert sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>299070</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water (BPW)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218105</td>
			<td>Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>7010</td>
			<td>Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie Explorer software</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>Version 2.0.6.3</td>
			<td>Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie II or Genie III (LAMP instrument)</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GEN2-02 or GEN3-02</td>
			<td>A small instrument capable of temperature control up to 100 &#176;C with &#177; 0.1 &#176;C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>OP-0008</td>
			<td>8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip holder</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GBLOCK</td>
			<td>Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SA48-500</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>88-860-022</td>
			<td>Heats samples at 100 &#177; 1 oC for DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>3960</td>
			<td>Standard laboratory incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-001 isothermal master mix</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>ISO-001</td>
			<td>An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>A416</td>
			<td>Disinfects work surfaces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td>
			<td>Custom</td>
			<td>LAMP primers with detailed information in Table 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td>
			<td>22620207</td>
			<td>MiniSpin plus personal microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Standard microcentrifuge tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AM9938</td>
			<td>Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R01202</td>
			<td>Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone water</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218071</td>
			<td>Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td>
			<td>Pipet Lite LTS series</td>
			<td>Standard laboratory pipettes and tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrepMan Ultra sample preparation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>4318930</td>
			<td>A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella reference strain LT2</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>700720</td>
			<td>Salmonella reference strain used as positive control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase soy broth (TSB)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>211768</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Standard laboratory vortex mixer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whirl-pak filter bag</td>
			<td>Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI</td>
			<td>B01318</td>
			<td>Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) hat sich als leistungsstarker Nukleinsäure-Amplifikationstest für den schnellen Nachweis zahlreicher bakterieller, Pilz-, Parasit- und Virusmittel herausgebildet. Salmonellen sind ein bakterieller Erreger, der weltweit für Lebensmittelsicherheit von Bedeutung ist, einschließlich Lebensmitteln für Tiere. Hier wird ein multilaboriertes Salmonella-LAMP-Protokoll vorgestellt, das verwendet werden kann, um Tiernahrung schnell auf das Vorhandensein von Salmonellenkontamination zu untersuchen, und kann auch verwendet werden, um mutmaßliche Salmonellenisolate zu bestätigen, die aus allen Lebensmittelkategorien gewonnen wurden. Der LAMP-Assay zielt speziell auf das Salmonella-Invasionsgen (invA) ab und ist schnell, empfindlich und hochspezifisch. Template DNAs werden aus Anreicherungsbrühen von Tierfutter oder reinen Kulturen von mutmaßlichen Salmonellenisolaten hergestellt. Die LAMP-Reagenzmischung wird durch die Kombination eines isothermen Master-Mixes, Primer, DNA-Schablone und Wasser hergestellt. Der LAMP-Assay läuft bei einer konstanten Temperatur von 65 °C für 30 min. Positive Ergebnisse werden über Echtzeitfluoreszenz überwacht und können bereits nach 5 min nachgewiesen werden. Der LAMP-Test weist eine hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren in tierischen Lebensmitteln oder Kulturmedien auf und dient als schnelle, zuverlässige, robuste, kostengünstige und benutzerfreundliche Methode zum Screening und zur Bestätigung von Salmonellen. Die LAMP-Methode wurde vor kurzem in das Kapitel 5 der U.S. Food and Drug Administration es Bacteriological Analytical Manual (BAM) aufgenommen.

Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen repräsentative LAMP-Diagramme/Tabellen, die auf beiden Plattformen angezeigt werden. In diesem LAMP-Lauf sind die Proben S1 bis S6 10-fach serielle Verdünnungen von S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 im Bereich von 1,1 x 106 KBE bis 11 KBE pro Reaktion. Positivist ist S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) bei 1,7 x 104 KBE pro Reaktion und NTC ist molekulares Wasser.
Wie in Abbildung 2E und Abbildung 3Gdargestellt, sind sowohl NTC- als auch PC-Bohrungen gültige Steuerungen. Der NTC-Brunnen hat leer Tmax, während Tm < 83 °C auf dem LAMP-Instrumentenpanel und leer in der LAMP-Software ist, was auf ein negatives Ergebnis hindeutet. Der PC-Brunnen hat Tmax. 7 min 45 sec und Tm von 90 °C auf beiden Plattformen, was auf ein positives Ergebnis hindeutet. Die Proben S1 bis S6 haben Tmax zwischen 6 min 30 sec und 12 min 15 sec, alle sind Salmonella-positiv.
Nach doppelten Ausführungen desselben Satzes von Stichproben werden die endgültigen LAMP-Ergebnisse für diese Stichproben gemeldet. Dieser repräsentative LAMP-Lauf zeigt, dass LAMP Salmonellen mit einer Vielzahl von Konzentrationen in den Proben erfolgreich erkennt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative LAMP-Ergebnisse, die auf dem LAMP-Instrumentenpanel angezeigt werden. (A) Die Registerkarte Profil zeigt das programmierte Temperaturprofil an. (B) Die Registerkarte Temperatur zeigt die tatsächlichen Temperaturen in den Probenbrunnen an, während die LAMP-Reaktion fortgesetzt wird. (C) Die Registerkarte Amplifikation zeigt Fluoreszenzwerte während der LAMP-Verstärkung. (D) Die Registerkarte Anneal zeigt Veränderungen der Fluoreszenz (Derivat) während der Nealphase. (E) Auf der Registerkarte Ergebnisse wird eine tabellarische Ansicht der LAMP-Ergebnisse angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative LAMP-Ergebnisse in der LAMP-Software angezeigt. (A) Die Registerkarte Profil zeigt das programmierte Temperaturprofil an. (B) Die Registerkarte Temperatur zeigt die tatsächlichen Temperaturen in den Probenbrunnen an, während die LAMP-Reaktion fortgesetzt wird. (C) Die Registerkarte Amplifikation zeigt Fluoreszenzwerte während der LAMP-Verstärkung. (D) Die Registerkarte Amplifikationsrate zeigt Veränderungen der Fluoreszenz (Fluoreszenzverhältnis) während der LAMP-Verstärkung. (E) Die Anneal-Registerkarte zeigt Fluoreszenzwerte während der Nealphase. (F) Die Registerkarte Anneal-Derivat zeigt Veränderungen der Fluoreszenz (Derivat) während der Nealphase. (G) Die Registerkarte Ergebnis zeigt eine tabellarische Ansicht der LAMP-Ergebnisse an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist ein isothermer Nukleinsäure-Amplifikationstest (iNAAT), der ein breites Interesse am Nachweisvon Erreger geweckt hat. Hier präsentieren wir ein multilaboriertes Salmonella LAMP-Protokoll als schnelle, zuverlässige und robuste Methode zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und zur Bestätigung mutmaßlicher Salmonellen aus der Kulturisolierung.

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und Bestätigung von Salmonellen aus der Kulturisolierung

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

7.9K Aufrufe.  U.S. Food and Drug Administration. Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist ein isothermer Nukleinsäure-Amplifikationstest (iNAAT), der ein breites Interesse am Nachweisvon Erreger geweckt hat. Hier präsentieren wir ein multilaboriertes Salmonella LAMP-Protokoll als schnelle, zuverlässige und robuste Methode zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und zur Bestätigung mutmaßlicher Salmonellen aus der Kulturisolierung.

Serie: Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and tumorigenesis. Many researchers have taken advantage of the colitis induced by Salmonella typhimurium for the studies on the early phase of inflammation and infection. However, only few reports are on the chronic infection in vivo. Mice with Salmonella persistent existence in the gastrointestinal tract allow us to explore the long-term host-bacterial interaction, signal transduction, and tumorigenesis. We have established a chronic bacterial infected mouse model with Salmonella typhimurium colonization in the mouse intestine over 6 months. To use this system, it is necessary for the researcher to learn how to prepare the bacterial culture and gavage the animals. We detail a methodology for prepare bacterial culture and gavage mice. We also show how to detect the Salmonella persistence in the gastrointestinal tract. Overall, this protocol will aid researchers using the bacterial infected mouse model to address fundamentally important biological and microbiological questions.

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Establish a chronic bacterial infected mouse model with persistent Salmonella typhimurium colonization in intestine for 27 weeks.

Chronisch Salmonellen Infected Maus-Modell

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

Forschung

Biologie

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also termed the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The reproductive axis is a key integrator of environmental and internal input adapting fertility to favorable conditions for reproduction. Prior to embarking upon a fertility study in mice and rats, sexual maturity is evaluated to exclude the possibility that the observed reproductive phenotypes are caused by delayed or absent pubertal onset. This protocol describes a non-invasive approach to assess pubertal onset in males through the determination of preputial separation, and in females through vaginal opening and first estrus. After the confirmation of the completion of puberty and the achievement of sexual maturity, a fertility study can be initiated. The procedure describes the optimal breeding conditions for mice and rats, how to set up a fertility study, and what parameters to evaluate and determine if the treatment or gene deletion has an impact on fertility.

Many treatments and genetic mutations impact the timing of sexual maturity and fertility. This protocol describes a non-invasive method to evaluate pubertal onset in mice and rats prior to setting up a fertility study in sexually mature animals.

Bestimmung der reproduktive Kompetenz durch Bestätigung pubertären Beginn und Durchführung eines Fruchtbarkeit Assays bei Mäusen und Ratten

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Quasi-metagenomischen Analyse Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an incredible diversity of microbial life and can be a good source of these bioremediative fungi. This work aims to search for soil fungi with bioremediation potential by using different screening tests. Mineral culture media supplemented with recalcitrant substances as the sole carbon source were used as growth tests. First, soil dilutions were plated on Petri dishes with mineral medium amended with humic acids or lignocellulose. The growing fungal colonies were isolated and tested on different substrates, such as complex mixtures of hydrocarbons (petrolatum and used motor oil) and powders of different plastic polymers (PET, PP, PS, PUR, PVC). Qualitative enzymatic tests were associated with the growth tests to investigate the production of esterases, laccases, peroxidases, and proteases. These enzymes are involved in the main degradation processes of recalcitrant material, and their constitutive secretion by the examined fungal strains could have the potential to be exploited for bioremediation. More than 100 strains were isolated and tested, and several isolates with good bioremediation potential were found. In conclusion, the described screening tests are an easy and low-cost method to identify fungal strains with bioremediation potential from the soil. In addition, it is possible to tailor the screening tests for different pollutants, according to requirements, by adding other recalcitrant substances to minimal culture media.

Here, we present a protocol for screening soil biodiversity to look for fungal strains involved in the degradation of recalcitrant materials. First, fungal strains able to grow on humic acids or lignocellulose are isolated. Their activity is then tested both in enzymatic assays and on pollutants such as hydrocarbons and plastics.

Isolierung und Screening aus der Bodenbiodiversität auf Pilze, die am Abbau widerspenstiger Materialien beteiligt sind

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Einzelzell-Suspensionspräparat aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Verwendung von kolorimetrischer und RT-LAMP-Analyse zum Nachweis von SARS-CoV-2 

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern society because many people die as a result of infection. The disease is diagnosed using serologic and molecular tests, such as the gold standard real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The last has several disadvantages because it requires specialized infrastructure, costly equipment, and trained personnel. Here, we present a protocol outlining the steps required to detect the SARS-CoV-2 virus using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) in human samples. The protocol includes instructions for designing primers in silico, preparing reagents, amplification, and visualization. Once standardized, this method can be easily implemented and adapted to any laboratory or point-of-care within 60 min at a low cost and using inexpensive equipment. It is adaptable to detecting different pathogens. Thus, it can potentially be used in the field and in health centers to carry out timely epidemiological surveillance.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Erregerdiagnostik mit standardisiertem LAMP

Here we provide a complete protocol to standardize and implement the method for detecting the SARS-CoV-2 virus in human samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method, done within 60 min, could be adapted to any laboratory or point-of-care at a low cost and using inexpensive equipment.

Nachweis des SARS-CoV-2-Virus durch reverse Transkriptionsschleifen-vermittelte isotherme Amplifikation

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

Verwendung von bakteriellem LPS zur Eliminierung von Bakteriophagen aus Salmonellenkulturen

Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures

Bacteriophages, or simply phages, play a vital role in microbial environments, impacting bacterial populations and shaping their evolution and interactions. These organisms are viruses that infect and replicate within bacterial hosts. Phages are ubiquitous on Earth, highly diverse, and very abundant. While bacteriophages have valuable roles in different environments and are a key area of research in microbiology and ecology, their presence can be undesirable in certain industrial processes or products. Considering the abundance and ubiquity of bacteriophages on Earth, the design of procedures for the removal of bacteriophages from bacterial cultures is crucial in diverse laboratory and industrial applications to preserve the integrity of the cultures and ensure accurate experimental results or product quality. Here, we have fine-tuned a protocol to eliminate the bacteriophages from infected Salmonella enterica cultures, using a strategy based on the use of lipopolysaccharides (LPS) located in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Bacterial LPS plays an important role in host recognition by phages, and we make use of this property to design an effective procedure for the removal of phages, which use LPS as a receptor, in Salmonella bacterial cultures.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Eliminierung von Bakteriophagen aus infizierten Salmonellenkulturen mit Lipopolysacchariden

Bacteriophages, ubiquitous and diverse on Earth, infect and replicate within bacterial hosts, playing a crucial role in microbial ecosystems. Despite their importance, their presence may disrupt industrial processes. We have developed a method using bacterial lipopolysaccharides to eliminate bacteriophages from Salmonella cultures.