Wir danken Herrn Craig D. Slaven (Department of English, University of Kentucky) für die redaktionelle Unterstützung. Unterstützt von der University of Kentucky, Department of Biology, Office of Undergraduate Studies and College of Arts &amp; Sciences.

1) Einführung Motor Neurone mit einer Muskelfaser an Synapsen, die gemeinsam als neuromuskulären Synapse (NMJ) bezeichnet kommunizieren. NMJs kann leicht in den meisten Krebse Muskel Vorbereitungen zugegriffen werden. Viele der Krebse NMJs demonstrieren nicht spiking exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP) ähnlich wie die abgestufte elektrische Signale in postsynaptischen Dendriten innerhalb der Säuger-ZNS-oder unterschwelligen Reaktionen in Vertebraten NMJs angemerkt erzeugt (Wiersma &amp; Van Harreveld, 1938; Katz &amp; Kuffler, 1946) . Die Krebse NMJs kann als grundlegende synaptischen Modelle dienen dazu, allgemeine Einsichten in die synaptische Übertragung und synaptischen Differenzierung. Im Allgemeinen regeln motorischen Einheiten Aspekte des Verhaltens von Tieren über die Art der synaptischen Kommunikation NMJs und Eigenschaften der Muskeln. Seit der ersten Beobachtung von &quot;schnell&quot; und &quot;langsame&quot; Muskelkontraktionen in Krabben und Krebse näher Muskel (Lucas, 1907, 1917), hat ähnliche muskuläre Kontraktion Differenzierung in andere Krebse Muskel-Typen wie Bauch-Beuger (Kennedy &amp; Takeda, 1965a beschrieben worden , b) Leib und Strecker (Van Harreveld &amp; Wiersma, 1936). &quot;Fast&quot; Wehen einleiten schnellen Antworten. Zum Beispiel ist die Krebse Schwanz Flip eine schnelle Verhalten. &quot;Slow&quot; Kontraktionen zu erhalten langsamen Bewegungen und zur Erhaltung der Haltung (Bradacs et al., 1997). Entsprechend &quot;schnell&quot; und &quot;langsame&quot; Muskelkontraktionen, &quot;phasischen / high output&quot; und &quot;tonisch / low output&quot; werden allgemein die motorischen Neuronen zu beschreiben. Der Unterschied in der Geschwindigkeit und der Zeitpunkt der Muskelkontraktion ist zum Teil im Zusammenhang mit präsynaptischen Unterschiede in der synaptischen Struktur und synaptischen Stärke (King et al., 1996). Myofibrilläre Protein-Isoform-Expression ist auch in kontraktilen Unterschiede wichtig, aber in Vorbereitung wie die des Beines Streckmuskel, in dem eine bestimmte Faser, die durch beide Arten von Motoneuronen innerviert ist, liegt der Fokus auf die synaptische Unterschiede der Terminals, da die Terminals Aktien die gleiche Zielzelle (Mykles et al., 2002). Eine frühere Studie untersuchten die beiden erregenden motorischen Axone des Beines extensor und beschrieb die phasischen und tonischen Phänotypen (Bradacs et al., 1997). In diesem Bericht zeigen wir, wie man die Zerlegung durchführen und erhalten Aufnahmen, so dass andere weiter zu untersuchen, können die Eigenschaften der synaptischen Differenzierung dieser Nervenendigungen. Betrachtet mit Transmissions-Elektronenmikroskopie, verschiedene Reihe von Abschnitten aus der tonische und phasische Terminals auf Krebse Bein Streckmuskel erhalten ergaben, dass Tonic Terminals mehr RRP Vesikel als phasische Terminals enthalten, die Mitochondrien sind häufiger in tonische Neuronen und Synapsen auf phasische Terminals sind komplexer als die der Low-Output-Synapsen, da sie enthalten mehrere aktive Zonen mit unterschiedlichen Abständen (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). Die Low-Output-Tonic-Terminals sind auch anfälliger für die Verbesserung der synaptischen Übertragung mit dem Neuromodulator Serotonin (5-HT) als die phasischen Terminals (Cooper et al., 2003). Die Tatsache, dass die tonische und phasische NMJ auf dem gleichen Muskelfasern sind erleichtert präsynaptischen Unterschiede auf einer bestimmten Muskelfaser zu bewerten und zu Fragen der Muskelermüdung, synaptische Depression und synaptische Übersprechen Adresse. Verschiedene Fragen müssen noch in diesem Präparat behandelt werden, wie zum Beispiel, ob es Unterschiede in der postsynaptischen Rezeptor-Dichte und Glutamat-Rezeptor-Subtypen in postsynaptischen Ziele für die tonische und phasische Terminals, sondern ein besseres Verständnis der grundlegenden Unterschiede in der Anatomie und Physiologie dieser zwei Motor-Einheiten werden in den Aufbau einer tieferen Wissensbasis zu unterstützen. Die Hoffnung ist, dass die grundlegenden Prinzipien in dieser synaptischen Vorbereitung gelernt werden auf andere Synapsen in verschiedenen Zubereitungen und zukünftige Untersuchungen in diesem synaptischen Modell des Krebses zu erhöhen. 2) Die Methoden <ol><li> Alle Experimente werden auf der ersten oder zweiten Laufbeinen mittelständischer Krebse (Procambarus clarkii) durchgeführt. Die Tiere werden einzeln in Kunststoff-Behälter mit oxygenized Wasser untergebracht. Die Temperatur des Tieres Zimmer liegt im Bereich von 13 ° C-16 ° C. Die Tiere sind mit einem trockenen Fischfutter und das Wasser auf einer wöchentlichen Basis geändert zugeführt. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Krebse Fuß Bein und den sechs distalen Segmente. </li><li> Der distale Aspekt der Fuß Bein in einem Flusskrebs ist anatomisch in sechs Segmente (Abbildung 1) eingeteilt. Das Bein extensor ist in der meropodite befindet, und das Nervenbündel, das isoliert sein wird, ist in der Nähe des meropodite ischiopodite Gelenk. Das Tonikum oder phasische Axon kann be selektiv stimuliert wie für physiologische Zwecke benötigt, nachdem sie ausgesetzt sind. </li><li> Cooper und Cooper (2009) beschrieb einige Aspekte der ersten Sektion, einschließlich der Methoden für das Freilegen der Erreger des Openers Motoneuronen im meropodite Region, aber ihre Beschreibung nicht die Sorge für den Schutz der Extensoren von Schäden erforderlich ist, wie es war nicht erforderlich, um den Opener Muskel-Präparat Adresse. Um die extensor zu schützen, ist die erste oder zweite Fuß Bein von der Krebse entfernt, Mess 6-10 cm Körperlänge (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), durch die Induktion des Tieres auf die Gliedmaßen mit kräftigen Kneifen automatisieren distal der Bruchfläche in der ischiopodite Segment. Das Bein wird auf die Präparation Platte mit den seitlichen (Außenseite) dem Betrachter zugewandt platziert. Das Bein ist rund, bis der Betrachter sicher sein können, nach außen (lateral) Seite nach oben auf die Zerlegung Platte, in der Regel mit der gewölbten Seite nach oben (Abbildung 2) eingeschaltet. Aufstellen des Beins auf einem Stück Seidenpapier erleichtert die Vorbereitung wiederum während Sie diese Kürzungen. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Die Außenseite des meropodite, in der Regel die Seite, ist gewölbt, nach oben auf die Zerlegung Platte .. </li><li> Mit einem Skalpell Leistungsschalter und Halter, ist eine scharfe Rasierklinge zu ätzen die Kutikula bis kurz Durchtrennen in das Muster in Abbildung 3 für die meropodite Segment ausgewiesen werden. Es wird darauf geachtet, nicht zu weit distal an der dorsalen Schnitt nach ventral Schnitt durch die meropodite-carpopodite Gelenk. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Die meropodite Segment mit Zeilen wie eine vorgeschlagene Muster für das Ätzen aus dem Fenster der Nagelhaut. Die Zubereitung ist in Kochsalzlösung gelegt. Die Dissektion Gericht sollte eine Sylgard (Dow Corning)-Beschichtung auf der Unterseite (1 cm dick). Die Sylgard so verwendet wird, das Insekt Stifte in kann für die Abhaltung der Vorbereitung noch beklebt werden. An dieser Stelle ist ein Stift in der Mitte des carpopodite Segment und in der Dorsalseite des ischiopodite Segment (Abbildung 4) stecken. Dissected Vorbereitungen sind in Standard-Krebse Kochsalzlösung getaucht, modifiziert nach Van Harreveld s Lösung (1936), die mit 205 NaCl hergestellt wird; 5.3KCl; 13,5 CaCl 2; 2H 2 O, 2,45 MgCl 2; 6 H 2 O, 5 HEPES und angepasst pH 7,4 (in mm). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: Die meropodite Segment mit geschnittenen Fenster abgehoben wird. Beachten Sie die Lage der Dissektion Pins. </li><li> Die Nagelhaut wird sanft in den distalen Bereich angehoben und die Muskelfasern sind weg von der Nagelhaut, indem sie Schläge auf der Basis des Hosenbein. Die Nagelhaut kann abgehoben werden. </li><li> Die apodeme (Sehne) am meropodite-carpopodite gemeinsame geschnitten. Ein Stift ist an der inneren Oberfläche der Beugesehne, um zu zeigen, wo der Schnitt gemacht (Abbildung 5) platziert werden. Die Sehne wird dann gekniffen, wo sie mit einer Pinzette und die Beugemuskeln zog, indem Sie ihn in einem kaudal (Abbildung 6), Freilegung der Hauptlauf Nerven und die Extensoren geschnitten wurde. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Die apodeme der Beugemuskeln ist, durch Verschieben der flexor mit einem Stift markiert. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6: Die apodeme der Beugemuskeln abgeschnitten und entfernt mit Vorsicht, da nicht der Hauptlauf Nervenschäden. </li><li> Der Hauptlauf Nerv an der meropodite-carpopodite gemeinsame geschnitten und sorgfältig wieder über die Extensoren gezogen. Die mediale Fläche des Muskels wird in dieser Studie verwendet. Die Trennung der Nerven auf die Extensoren von den Hauptlauf Nerv kann durch leichtes Ziehen am distalen Stumpf der Hauptlauf Nerven an der Seite des Präparats erhöht werden. Beim Schälen der Hauptlauf Nerven wieder über die Extensoren, können kleine Äste von Axon müssen geschnitten werden. Diese sind Zweige von den hemmenden motorischen Neurons auf die Extensoren. Die größeren Bündel abzweigt aus dem Hauptlauf Nerven in der Nähe des proximalen Endes des meropodite ist das kleine Nervenbündel von Interesse. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7: Der Hauptlauf Nerv geschnitten und wieder in eine proximale Richtung gezogen. Das Nervenbündel mit Methylenblau-Färbung (Abb. 8) oder mit gesehen werden 4-Di-2-ASP Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 9). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8: Die Extensoren mit Methylenblau gefärbt. Beachten Sie das Axon verzweigt und diezwei leicht sichtbar Axone im Nerv. Rote Pfeile demark den Nerv zu verfolgen. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig9.jpg" alt="Abbildung 9" /> Abbildung 9: Die Axone der motorischen Nerven gefärbt mit 4-Di-2-ASP. Das Tonikum Axon ist strahlend sichtbar aufgrund der erhöhten mitochondrialen Inhalt. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10a.jpg" alt="Abbildung 10A" /> Abbildung 10A: Individual-Terminals der phasischen und tonischen Neuronen mit 4-Di-2-ASP gefärbt. Notieren Sie sich die Krampfadern auf der Tonika-Terminals und die dünne Beschaffenheit der phasischen Terminals. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10b.jpg" alt="Abbildung 10B" /> Abbildung 10B-Tonic beachten <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10c.jpg" alt="Abbildung 10C" /> Abbildung 10C-Phasische beachten </li></ol> 3) Physiologische Profile <ol><li> Zur Wahrung der exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) der Tonika oder phasische Neuronen, ist einer der isolierten Axone im Nerven-Bündel durch eine Saug-Elektrode (Abbildung 11) verbunden mit einem Grass-Stimulator stimuliert, während intrazellulären Potentiale im Muskel überwacht werden (Johnstone et al., 2008). Stimulation bei 70 Hz ist die Tonika Axon angewandt, um eine erleichterte Reaktion für die geringe Leistung NMJs zu fördern, oder ein einzelner Impuls (1 Hz) ist die phasische Axon angewendet, um große EPSPs der hohe Leistung zu erhalten NMJs wie gezeigt in Abbildung 12. Die EPSPs werden an einen Computer über ein PowerLab/4s Schnittstelle aufgezeichnet. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig11.jpg" alt="Abbildung 11" /> Abbildung 11: Stimulationselektrode über ein einzelnes Axon innerhalb der Nerven-Bündel gelegt. Beachten Sie die grüne Linie, in der die 2 wichtigsten Axone. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig12.jpg" alt="Abbildung 12" /> Abbildung 12: postsynaptischen Potentiale (EPSPs) der Tonika oder phasische Neurone durch intrazelluläre Ableitungen erhalten. </li><li> Untersuchung in der Natur der synaptischen Erleichterung und synaptische Depression kann durch verschiedene experimentelle Paradigmen mit dem Low-und High-Ausgang NMJs angefahren werden. Erleichterung der geringen Leistung NMJs hängt von der Frequenz, wie für die 20, 40 und 60 Hz Impulsen von etwa 20 Reize (Abbildung 13) dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig13.jpg" alt="Abbildung 13" /> Abbildung 13: EPSPs in Reaktion auf einen Zug von Stimulationsimpulsen bei drei verschiedenen Frequenzen 20, 40 und 60 Hz in normalen Krebse Kochsalzlösung verabreicht. </li><li> Die Rate der synaptische Depression auf die Frequenz der Stimulation ist auch die hohe Leistung NMJs verwandt. Abbildung 14 zeigt einen kontinuierlichen 5 Hz Stimulation Drücken der NMJ über 30 min. Bei höheren Stimulationsfrequenz, wird die Vorbereitung schneller drücken (Bradacs et al., 1997). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig14.jpg" alt="Abbildung 14" /> Abbildung 14: EPSP Amplitude der phasischen Reaktion während 5 Hz Stimulation Depressionen auslösen. </li></ol> 4) quantal Responses <ol><li> Ein Verfahren ähnlich wie bei dem Opener Muskeln des Krebses (Cooper und Cooper, 2009) beschrieben wird, in dieser Zubereitung verwendet. Die quantal EPSPs direkt über identifizierbare Regionen der Nervenendigung werden, indem das Lumen eines Makro-patch Aufnahme Elektrode auf die synaptische Krampfadern aufgezeichnet visualisiert mit den vitalen Farbstoff 4-Di-2-Asp (5 uM, 5-min-Behandlung, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. Die spontane sowie evozierte quantal Antworten können entlang der Nervenendigungen aufgenommen werden. Die evozierte und spontane synaptische Potentiale sind mit der Makro-Patch-Elektrode (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993) erfasst. Kimax Glas (Außendurchmesser: 1,5 mm) gezogen wurde und Feuer-poliert, um Patch-Tipps mit Innen-Durchmessern von 10 bis 20 um (Abbildung 15) zu produzieren. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig15.jpg" alt="Abbildung 15" /> Abbildung 15: Das Lumen eines Makro-patch Aufnahme Elektrode .. Das Lumen der Elektrode ist mit dem Bade Medium gefüllt ist. Der Verstärker ist die gleiche wie die für die intrazelluläre Aufnahme oben genannten verwendet. Elektrode und Dichtung Widerstand kann durch das Bestehen der Prüfung Stromimpulse durch die Elektrode bestimmt werden. In unseren Experimenten lagen Abdichtwiderstande 0,3 bis 1,0 MOhm und die Elektrode Widerstand reichte von 0,5 bis 1,0 MOhm. Seal Widerstand kann während der Aufnahme kontrolliert werden. </li><li> Direkte Zählung der quantal Ereignisse mit geringer Stimulation Frequenzen möglich. Für jede evozierte, kann die Anzahl der quantal Ereignisse ohne weiteres für die geringe Ausgangsklemmen bestimmt werden (Figure 16). Diese direkten zählt helfen Schätzung der mittleren quantal Inhalt (Del Castillo &amp; Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Da die evozierten hohe Leistung NMJs multi-quantal evozierten Ereignisse, die mittlere Amplitude oder Gebiet der Ausschläge, zusammen mit der durchschnittlichen Amplitude oder Gebiet der spontanen Ereignisse zu produzieren, kann die Angleichung der mittleren quantal Inhalt (Cooper et al verwendet werden., 1995). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig16.jpg" alt="Abbildung 16" /> Abbildung 16 Focal Spuren von einer phasischen und tonischen NMJ aufgezeichnet. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig17.jpg" alt="Abbildung 17" /> Abbildung 17 </li></ol>

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	<li>Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+synaptic+physiology+of+crustacean+neuromuscular+systems.">Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems.</a> Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).</li><li>Atwood, H. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+diversity+and+differentiation:+Crustacean+neuromuscular+junctions.">Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions.</a> Invertebrate Neuroscience. 1, 291-307 (1996).</li><li>Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+physiology+and+morphology+of+phasic+and+tonic+motor+axons+in+a+crayfish+limb+extensor+muscle.">Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle.</a> J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).</li><li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions,+and+rat+hippocampus.">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J. Neurosci Methods. 61, 67-78 (1995).</li><li>Cooper, R. L., Donmezer, A., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+sensitivity+to+5-HT+between+high-+and+low-output+terminals+innervating+the+same+target.">Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target.</a> Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).</li><li>Cooper, A. S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+view+and+demonstration+of+physiology+at+the+NMJ+at+the+crayfish+opener+muscle.">Historical view and demonstration of physiology at the NMJ at the crayfish opener muscle.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> J. Physiol. 124, 560-573 (1954).</li><li>Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+synaptic+function+during+short-term+facilitation+in+motor+nerve+terminals+in+the+crayfish.">Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 24-35 (2008).</li><li>Desai-Shah, M., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+Ca2++regulation+that+influence+synaptic+transmission:+Comparison+between+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: Comparison between crayfish and Drosophila neuromuscular junctions.</a> SYNAPSE. 63, 1100-1121 (2009).</li><li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+at+the+crayfish+neuromuscular+junction.">The effect of reduced calcium on quantal unit at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pfl gers Arch. 391, 35-40 (1981).</li><li>Griffis, B., Moffett, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+phenotype+remains+unaltered+after+limb+autotomy+and+unloading.">Muscle phenotype remains unaltered after limb autotomy and unloading.</a> J. Exp. Zool. 289, 10-22 (2001).</li><li>Harata, N., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Mozhayeva, M., Kavalai, E. T., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+numbers+of+recycling+vesicles+in+small+CNS+nerve+terminals:+implications+for+neural+signaling+and+vesicular+cycling.">Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling.</a> Trends in Neurosci. 24, 637-643 (2001).</li><li>Jeromin, A., Shayan, A. J., Msghina, M., Roder, J., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+frequenins:+molecular+cloning+and+differential+localization+at+neuromuscular+junctions.">Crustacean frequenins: molecular cloning and differential localization at neuromuscular junctions.</a> J. Neurobiol. 41 (2), 165-175 (1999).</li><li>Johnstone, A. F. M., Kellie, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+depression+in+phasic+motor+nerve+terminals+and+influence+of+5-HT+on+docked+vesicles.">Presynaptic depression in phasic motor nerve terminals and influence of 5-HT on docked vesicles.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 16-23 (2008).</li><li>Katz, B., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+the+nerve-muscle+system+in+Crustacea.">Excitation of the nerve-muscle system in Crustacea.</a> Proc. Roy. Soc. B. 133, 374-389 (1946).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+I.+The+twitch+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. I. The twitch system.</a> J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+II.+The+tonic+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. II. The tonic system.</a> J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).</li><li>King, M. J. R., Atwood, H. L., Govind, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+crayfish+phasic+and+tonic+neuromuscular+junctions.">Structural features of crayfish phasic and tonic neuromuscular junctions.</a> J. Comp. Neurol. 372, 618-626 (1996).</li><li>LaFramboise, W., Griffis, B., Bonner, P., Warren, W., Scalise, D., Guthrie, R. D., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+type+specific+myosin+isoforms+in+crustacean+muscles.">Muscle type specific myosin isoforms in crustacean muscles.</a> J. Exp. Zool. 286, 36-48 (2000).</li><li>Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+vesicles+pools+within+motor+nerve+terminals+during+short-term+facilitation+and+neuromodulation.">Regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation.</a> J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2006).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+complex+excitable+tissues+by+their+response+to+electric+currents+of+short+duration.">The analysis of complex excitable tissues by their response to electric currents of short duration.</a> J. Physiol. 35, 310-331 (1907).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+summation+of+propagated+disturbances+in+the+claw+of+Astacus+and+on+the+double+neuromuscular+system+of+the+abductor.">On summation of propagated disturbances in the claw of Astacus and on the double neuromuscular system of the abductor.</a> J. Physiol. 51, 1-35 (1917).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).</li><li>Millar, A. G., Bradacs, H., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+relationship+between+release+probability+and+readily+releasable+vesicles+in+depressing+and+facilitating+synapses.">Inverse relationship between release probability and readily releasable vesicles in depressing and facilitating synapses.</a> J. Neurosci. 22, 9661-9667 (2002).</li><li>Millar, A. G., Zucker, R. S., Ellis-Davies, C. G., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+of+neurotransmitter+release+differs+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium sensitivity of neurotransmitter release differs at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 25, 3113-3125 (2005).</li><li>Msghina, M., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+structure+and+transmitter+release+in+crustacean+phasic+and+tonic+motor+neurons.">Synaptic structure and transmitter release in crustacean phasic and tonic motor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 1374-1382 (1998).</li><li>Msghina, M., Millar, A. G., Charlton, M. P., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+entry+related+to+active+zones+and+differences+in+transmitter+release+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium entry related to active zones and differences in transmitter release at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 19, 8419-8434 (1999).</li><li>Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillar+protein+isoform+expression+is+correlated+with+synaptic+efficacy+in+slow+fibres+of+the+claw+and+leg+opener+muscles+of+crayfish+and.">Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and.</a> 205 (4), 513-522 (2002).</li><li>Sparks, G., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+offsets+homeostasis+of+synaptic+transmission+during+short-term+facilitation.">5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation.</a> J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).</li><li>Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical,+physiological+and+biochemical+characterization+of+muscles+associated+with+the+articulating+membrane+in+the+dorsal+surface+of+the+crayfish+abdomen.">The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen.</a> J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).</li><li>Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles,+quanta+and+synaptic+plasticity.+Molecular+Mechanisms+of+synaptic+function.">Vesicles, quanta and synaptic plasticity. Molecular Mechanisms of synaptic function.</a> , (2001).</li><li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+solution+for+freshwater+crustaceans.">A physiological solution for freshwater crustaceans.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).</li><li>Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+innervation+of+the+crayfish+muscle.">The triple innervation of the crayfish muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, 667-667 (1936).</li><li>Wiersma, C. A. G., Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+frequency+of+stimulation+on+the+slow+and+fast+contraction+in+crustacean+muscle.">The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle.</a> Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).</li><li>Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+recruitment+of+silent+synapses.">Activity-dependent recruitment of silent synapses.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).</li></ol>

Wir haben in diesem Bericht gezeigt, wie zu sezieren, aufzuzeichnen und zu quantifizieren synaptischen Antworten in einer einzigartigen Krebse neuromuskuläre Vorbereitung, in denen beide High-und Low-Ausgänge innervieren die gleichen Muskelfaser. Die neuromuskuläre Präparate in die Krebse bieten viele Vorteile gegenüber Wirbeltieren neuromuskulären Verbindungen, da nur wenige exzitatorischen Motoneuronen benötigt werden, um einen Muskel innervieren, und da die Neuronen erkennbar von der Vorbereitung bis Vorbereitung (Atwood, 1976). Darüber hinaus ist die erregenden Neurotransmitters Glutamat, und die exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP) werden benotet, daher werden die biophysikalischen Eigenschaften von abgestuften Veranstaltungen analog zu den Dendriten der Neuronen im ZNS der Wirbeltiere. Die quantal Ströme können aber direkt an der postsynaptischen Websites (Cooper et al., 1995) überwacht werden. Repetitive 5 Hz Stimulation der phasischen Nerven führt zu großen EPSPs, die sich stark nach einigen Minuten werden depressiv. Diese Art der Depression ist häufig bei Arthropoden phasischen motorischen Endplatten (Atwood und Cooper, 1996). Die Anwesenheit der Tonika-Terminals neben der phasischen Terminals erlaubt es, festzustellen, ob die postsynaptische Ziel stark während und nach der Depression der phasischen motorischen Neurons verändert. Darüber hinaus bieten die niedrigen Ausgangsklemmen eine schöne Vorbereitung auf die Mechanismen, die synaptischen Erleichterung zugrunde zu untersuchen (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah und Cooper, 2009) Die hohe Leistung Terminals bieten einen Spielplatz der Modulation in Höhe von synaptische Depression und die Recovery-Prozess zu untersuchen. Zugänglich und lebensfähigen Präparate sollten bei der Entschlüsselung der Mechanismen, die hinter synaptische Depression zu helfen. In dieser Krebse Bein extensor Vorbereitung ist exogene Applikation von Serotonin ein weiteres Werkzeug zur Wiederherstellung von synaptische Depression und möglicherweise ein Mittel zur Förderung der Erforschung der Mobilisierung der synaptischen Vesikel-Pools zu untersuchen. Dieses Präparat enthält mehrere experimentelle Vorteile, da die einzelnen Muskelfasern von beiden phasischen und tonischen Motoneuronen innerviert. Da Serotonin erhöht die Anzahl der Vesikel, die mit evozierten Stimulation freigesetzt werden, und da es Genesung fördert während der Depression, ist es offensichtlich, dass es einige Modulation der Vesikel-Pools für die Verbesserung der Wahrscheinlichkeit der Fusion mit Serotonin vorhanden ist (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modelle, die die Dynamik der Vesikel-Pools innerhalb der präsynaptischen Nervenendigung erklären während niederfrequente Stimulation, um eine depressive Zustand entgegen, müsste auch unter den verschiedenen experimentellen Protokollen, die möglich sind mit diesem Präparat in Betracht gezogen werden. Es hat in anderen Systemen wurde festgestellt, dass etwa 30% der Vesikel-Pool eine schnelle Wiederverwertung unterzogen wird, während der Rest der Recycling-Vesikel durch einen traditionellen langsamen Recycling Weg gehen durch das endoplasmatische Retikulum (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Solche Dual-Pfade können auch vorhanden sein in diesem System. Wenn ATP im gedrückten Zustand der präsynaptischen Terminal fehlt, dann An-und Abdocken möglicherweise nicht eintreten, und so viele mehr entladen Vesikel würde bei der synaptischen Oberfläche bleiben. Seit mehr Vesikel schnell freigesetzt werden, wenn die Terminals 5 HT ausgesetzt sind, ist es denkbar, dass mehr in die leicht lösbare Pool (RRV) enthalten sind. Doch im gedrückten Zustand mit reduziertem ATP, kann die An-und Abdocken sogar in Gegenwart von 5-HT, die wieder verlässt entladen Bläschen an der synaptischen Oberfläche blockiert werden. Da die vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass mehr Bläschen im Laufe der Zeit sind mit verlängerten 5 HT Belichtung und Stimulation, die Verteilung der Vesikel-Pool von der schnellen und langsamen Recycling Pfade können verzerrt an die zuständigen Vesikel für re-release (von Johnstone et al freigegeben werden. , 2008, siehe Testberichte-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah und Cooper, 2009) Mit den Techniken der Schwerpunkt macropatch Aufnahmen von postsynaptischen Ströme und Maßnahmen der einzelnen Quanten aus definierten Regionen des motorischen Nerven Terminal kann man Fragen stellen, um festzustellen, ob synaptische Depression als Folge von weniger Vesikel freigesetzt oder wegen Veränderungen der Funktion auftretenden von postsynaptischen Rezeptoren. Es hat sich gezeigt, dass die Vesikel empfindlicher auf Fusion am phasischen NMJ dieser Zubereitung für eine gleiche Kalzium Exposition sind (Miller et al. 2005), die wahrscheinlich Konten für die höheren quantal Inhalt der phasischen Terminals (Msghina et al bedeuten. , 1998, 1999). Daneben wirken sich Unterschiede in der Calcium-bindende Protein frequenin (Jeromin et al., 1999) und Ultrastruktur (King et al., 1996), um die Differenz synaptischen Wirksamkeit (Cooper beitragenet al., 2003). (.; Cooper et al, 2003. Bradacs et al, 1997) Einige frühere Studien haben die Muskel-Phänotyp der extensor Muskelfasern untersucht. Vergleicht man die Regulierung von Muskel-Differenzierung für rein tonische und phasische Fasertypen in die Krebse auf gemischte Fasertypen, für das Bein extensor dass dumpf innerviert ist wie könnte Hinweise auf Muskel-Phänotyp Expression und Regulation (Laframboise et al, 2000 bereitzustellen;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002).. Viele grundlegende Fragen bleiben in der Neurobiologie angesprochen werden, und das Präparat kann bei der Bewältigung einige von ihnen zu helfen. Ein paar interessante Themen im Bereich heute bekannt, dass mit dem Bein extensor näherte sein könnte: 1) Bestimmung der zellulären Mechanismen, die synaptische Depression im High-Output-Anschlüsse unterliegen (Ist die Depression durch eine Reduktion der Ca2 +-Eintrag, das Fehlen eines kompetenten leicht lösbare Vesikel (RRV) Pool und / oder Veränderungen der postsynaptischen Empfänglichkeit?) 2) Die Bestimmung der mechanistische Rolle von 5-HT, wenn nach der Induktion der synaptischen Depression zu einer schnelleren Genesung und 3 zu fördern angewendet) Feststellung, ob die Formen der quantal Strömungen, die aus anregenden phasischen Terminals entstehen werden während der Induktion von Depressionen bis hin zu Vor-und postsynaptischen Komponenten synaptische Depression Adresse verändert. Diese NMJ ist wichtig, laufende Forschung und zukünftige Forscher, weil es uns ermöglicht, wichtige Informationen, dass die Untergebenen Mechanismen der synaptischen Leistung direkt an der Freisetzung Standorten gemessenen Adressen zu erhalten. Aktuelle Forschung in diesem Bereich ist die Bereitstellung von Informationen über die Modulation der synaptischen Depression, die durch 5-HT und die Dynamik der Vesikel-Pools. Solche Themen beziehen sich auf die wesentlichen Grundlagen der synaptischen Übertragung, die für alle neuronalen Systemen.

<ol><li> Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard-Krebse Kochsalzlösung: <ul><li> Geändert von Van Harreveld-Lösung (1936). (In mm) 205 NaCl, 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES und auf pH 7,4 eingestellt </li></ul></li><li> Dissection-Tools: Fine Nr. 5 Pinzette, feine Schere, Messer Messerhalter, # 26002-20 Insektennadeln (alle von Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139 erhalten) </li><li> Sylgard beschichtet Dissektion Gericht, eine Aufnahme Gericht entweder mit Saug-Elektrode gebaut oder mit einem Saug-Elektrode und Anthere Manipulators mit einer Saug-Elektrode zu halten. </li><li> Präpariermikroskop mit Zoom-Funktion für die intrazelluläre Aufnahme. Für fokale Aufnahme auf visualisiert Terminals ein zusammengesetztes Mikroskop mit aufrechten Ziele (4 x und 20x) verwendet wird. Man braucht eine Hg-Lichtquelle. </li><li> Standard intrazellulären Verstärker und A / D-Karte für Online-Aufzeichnung auf einem Computer. Elektrische Signale werden auf Linie zu einem PowerLab/4s Schnittstelle (ADInstruments, Australien) aufgezeichnet. Wir verwenden Standard-Software von ADInstruments namens Chart-oder Scope. </li><li> Chemicals: <ul><li> Wir verwenden eine wichtige Fluoreszenzfarbstoff, 4 [4 (diethylamino) Styryl] N methylpyridiniumiodid (4 DI 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), die Krampfadern (Marigassi et al, 1987 visualisieren;. Cooper et al, 1995a. ). Alle Kochsalzlösung Chemikalien wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten. </li></ul></li><li> Für intrazelluläre Ableitungen verwenden wir Glaskapillare Schlauch (Katalog # 30-31-0 von FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) und für fokale macropatch Elektroden verwenden wir Kimax-51, Kimble Products Kunst. Nr. 34502, ID 0,8-1.1mm, Länge 100mm. Die intrazelluläre Elektrode sollte einen Widerstand von 20 bis 30 mOhm. Die macropatch Elektrode wird durch den Abbruch der Spitze des Glases nach einer feinen Spitze von einer Elektrode Abzieher gemacht wurde gebaut. Die abgebrochene Spitze braucht, um eine saubere senkrecht zu brechen etwa 20 um im Durchmesser. Die Spitze wird dann Wärme poliert, um etwa 10 &amp;mgr; m Innendurchmesser. Der Schaft der Elektrode wird dann über ein Heizelement ausführen, um dazu führen, dass etwa 45 Grad mit einer allmählichen Kurve biegen. Dadurch entsteht eine ebene oder senkrecht Elektrode Lumen über die Nervenendigung als der Winkel mit dem Mikro-Manipulator wird über weitere 45 Grad auf die Vorbereitung zu produzieren. </li></ol>

physiological recordings of high and low output nmjs on the crayfish leg extensor muscle

Wir erklären im Detail, wie zu entlarven und zu leiten elektrophysiologischen Ableitungen der synaptischen Antworten für hoch (phasischen) und niedriger (Tonika) Ausgang Motoneuronen innervieren die Extensoren in den Fuß Bein eines Krebse. Deutliche Unterschiede sind in der Physiologie und Morphologie der phasischen und tonischen Nervenendigungen. Das Tonikum Axon enthält viele mehr Mitochondrien, so dass es einen wichtigen stärker als die phasischen Axon Fleck. Das Tonikum Terminals haben Krampfadern, und der phasischen Terminal ist fadenförmig. Das Tonikum-Terminals sind in der synaptischen Effektivität niedrig, aber zeigen dramatische erleichtert Antworten. Im Gegensatz dazu sind die phasischen Terminals in quantal Wirksamkeit hoch, aber zeigen synaptische Depression mit hoher Frequenz Stimulation. Die quantal Ausgang ist mit einer Brennweite macropatch Elektrode direkt über die visualisierte Nervenendigungen platziert gemessen. Beide phasischen und tonischen Terminals innervieren die gleichen Muskelfasern, die inhärenten Unterschiede in den Neuronen, anstatt Differential retrograde Feedback von den Muskeln, Konto für die morphologische und physiologische Differenzierung schlägt.

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Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

Dieser Artikel beschreibt, wie elektrophysiologischen Ableitungen der synaptischen Antworten auf die Extensoren Verhalten in den Fuß Bein eines Krebse und wie die Nervenendigungen werden visualisiert, um die Brutto-morphologischen Unterschiede von High-und Low-Output-Nervenendigungen zeigen.

Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

physiological-recordings-high-low-output-nmjs-on-crayfish-leg

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Aufrufe.  University of Kentucky. Dieser Artikel beschreibt, wie elektrophysiologischen Ableitungen der synaptischen Antworten auf die Extensoren Verhalten in den Fuß Bein eines Krebse und wie die Nervenendigungen werden visualisiert, um die Brutto-morphologischen Unterschiede von High-und Low-Output-Nervenendigungen zeigen.

Serie: Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

State-Dependency Auswirkungen auf TMS: Ein Blick auf Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Muscle-Rezeptor-Organe in der Crayfish Abdomen: Ein Schülerlabor Übung in Propriozeption

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings with a force transducer to monitor the strength of contraction. In addition, we demonstrate how to visually monitor peristaltic activity, which can be used as a bioassay for various peptides, biogenic amines and neurotransmitters. This preparation is amenable to student laboratories in physiology and for demonstrating pharmacological concepts to students. This preparation has been in use for over 100 years, and it still offers much as a model for investigating the generation and regulation of peristaltic rhythms and for describing the mechanisms underlying their modulation. The pharmacological assays and receptor sub-typing that were started over 50 years ago on the hindgut still contribute to research today. This robust preparation is well suited to training students in physiology and pharmacology.

In this report we demonstrate techniques that can be used to investigate the biology of the crayfish hindgut. We show how to dissect a crayfish abdomen and study the associated anatomy, physiology and modulation of activity. The peristaltic activity and strength of contractions are measured using a force transducer.

Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a noninvasive brain monitoring tool in cognitive neuroscience as well as a diagnostic tool for epilepsy and sleep disorders in neurology. However, the underlying mechanism of EEG rhythm generation is still under the veil. Recently introduced polyimide-based microelectrode (PBM-array) for high resolution mouse EEG1 is one of the trials to answer the neurophysiological questions on EEG signals based on a rich genetic resource that the mouse model contains for the analysis of complex EEG generation process. This application of nanofabricated PBM-array to mouse skull is an efficient tool for collecting large-scale brain activity of transgenic mice and accommodates to identify the neural correlates to certain EEG rhythms in conjunction with behavior. However its ultra-thin thickness and bifurcated structure cause a trouble in handling and implantation of PBM-array. In the presented video, the preparation and surgery steps for the implantation of PBM-array on a mouse skull are described step by step. Handling and surgery tips to help researchers succeed in implantation are also provided.

In this article, we described the surgery procedure and handling tips for implantation of ultra-thin polyimide-based microelectrode array (PBM-array) on the mouse skull for acquisition of high-density encephalography (EEG) in a mouse model.

High-Density-EEG-Aufzeichnungen der sich frei bewegenden Mäusen mit Polyimid-Basis Mikroelektroden

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...