Vor Beginn der Vorbereitung: <ul><li> Wandering yhird instar Drosophila-Larven </li><li> HL3.1 (Modified Hämolymphe-like)-Lösung </li><li> Sylgard (transparent Silikon-Kautschuk) Dissektion Platten in kleine (35 x 10 mm) Kunststoff-Petrischalen mit Methoden von Brent und McCabe (2008) 3 beschriebenen Verfahren hergestellt. </li><li> Cut Dissektion Stifte kurz </li><li> Stimulationselektrode Pipetten </li><li> Sharp Aufnahme Pipetten </li></ul> HL3 Lösung: <ol><li> 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 Trehalose, 115 Saccharose und 5 HEPES, pH 7,2: Während Dissektionen und elektrophysiologischen Experimenten werden Larve in HL3.1 Lösung 2, die (in mM) enthält, eingetaucht. </li><li> Die Konzentrationen von CaCl 2 sind die HL3.1 Lösung für die erforderliche Konzentration von extrazellulärem Ca 2 + zu addieren. <ul><li> Larven Dissektionen sind bei niedrigen Ca 2 +-Konzentrationen (die Muskelkontraktion zu vermeiden) mit HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, auf Eis gehalten durchgeführt. </li><li> Elektrophysiologische Experimente sind in der Regel in HL3.1 aufgezeichnet + 1 mM CaCl 2, aber das kann von 0,4 eingestellt werden - 1 mM Ca 2 + als erforderlich. </li></ul></li><li> Die Lösung ist HL3.1 Filter vor dem Gebrauch sterilisiert und bei 4 ˚ C. </li></ol> Vorbereitung der anregenden und Aufnahme Pipetten: <ol><li> Heat = 390, Filament = 4, Velocity = 35, Delay = 200 und Pull = 0:. Recording und anregende Pipetten sind mit einem Sutter P-2000 Laser basiert Mikropipette Abzieher mit den folgenden Einstellungen gezogen </li><li> Stimulationselektroden sind aus dünnwandigen Kapillaren aus Borosilikatglas mit breiten Enden, die etwas größer als die Breite der abgetrennten Motor Axone wurden vorbereitet. Die geformten Enden firepolished zu einer glatten Oberfläche (mit einer Pipette Narashiga Polierer), um Schäden an den Nerven zu minimieren geben. Stimulationselektroden sind ausgestattet mit Bad-Lösung (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +) gefüllt. </li><li> Die Aufnahme Elektroden sind aus 1,2 mm Borosilikatglas, das gezogen wird, um eine scharfe Pipette (30-60 mW) zu bilden, und mit 3M KCl vorbereitet. </li></ol> Teil 1: Präparation des Drosophila-Larven <ol><li> Drittens instar wandernde Larven werden seziert, um die Muskeln im Körper Wand freizulegen, wie beschrieben bisher 4. </li><li> Dissektionen sind in HL3.1 durchgeführt + 0,25 mM Ca 2 + auf kleinen Silikon-Platten (35 x 10 mm). HL3.1 Lösung muss eiskalten für Dissektionen werden, um die Larve zu betäuben, und ist auf dem Eis vor und während der Sektionen gehalten. </li><li> Die Larven werden seziert mit Methoden von Brent und McCabe (2008), dass für die Elektrophysiologie Experimenten durch Zugabe von 0,25 mM Ca 2 + auf die HL3.1 Dissektion Lösung, und mit kurzen Dissektion Pins (~ 2 mm in der Länge), die weniger verändert wird beschrieben wahrscheinlich das Mikroskop-Objektiv und Elektroden während eines Experiments getroffen. </li><li> Nach Dissektion, sind der Motor Axone der Larven durchtrennt. Dies wird durch leichtes Halten des ZNS und erhöhen sie leicht, so dass die peripheren Nerven, die die Muskeln hinter dem Bauchganglion innervieren, ohne die Muskeln (Abbildung 1) geschnitten werden kann getan. Das Gehirn wird dann entfernt. </li><li> Die seziert Larven Vorbereitung wird zweimal mit HL3.1 gewaschen + 1 mM Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritte bei der Reduzierung der Motor Axone seziert Larven beteiligt. Das ZNS ist mit einer Pinzette angehoben und der Motor Axone sind an der Basis des Gehirns geschnitten. Teil 2: Intrazelluläre Aufnahme von Larven Muskelzellen. <ol><li> Legen Sie die Dissektion Platte auf der Elektrophysiologie Mikroskop und tauchen prep mit HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + und fixieren Badelektrode so dass es in Kontakt mit der Lösung ist. </li><li> Alle Experimente sind auf Muskel-6 innerhalb der dritten Abdominalsegment (A3) durchgeführt. Periphere Nerven, die die Muskeln innervieren angeregt mit einem Saug-Elektrode 5. </li><li> Position der stimulierenden Elektrode in die Schüssel ersten Erschütterungen zu vermeiden, wenn die intrazelluläre Elektrode vorhanden ist. Setzen Sie den stimulierenden Elektrode in unmittelbarer Nähe des motorischen Neurons innervieren einen Muskel 6 und gelten sanfte Saugwirkung, bis der Schnitt Nerv im Inneren der Glaspipette. Achten Sie darauf, nicht auf die Nerven dehnen, wenn Saug angewendet wird. Heben Sie die Pipette etwas so ist es nicht berühren, die Muskel-und positionieren Sie es, damit es nicht zieht sich auf den Schnitt Nervenfasern (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="Abbildung 2" width="600" height="296" /> Abbildung 2. Eine schematische Darstellung der Muskulatur und innervieren Motoneuronen eines Abdominalsegment aus der Drosophila Larve. Die Position des anregenden Pipette und durchtrennten Nerven und die Aufnahme Elektrode in Position Muskel 6 sind dargestellt. </li><li> Intrazellulären Aufnahmen sind mit scharfen Mikroelektroden mit 3 M KCl gefüllt. Position der Aufnahme-Elektrode oberhalb des Zentrums von Muskel-6 auf dem dritten Abdominalsegment (A3) und stellen Sie die Eingangs-Offset so dass es Null für die Badlösung liest. Langsam senken die Elektrode und Ansatz des Muskels unter hohem optischen Vergrößerung, bis er den Muskel Oberfläche berührt. Sehen Sie sich das Oszilloskop, um zu bestätigen, dass der Muskel wurde durchbrochen. Das Ruhemembranpotential sollte mindestens -60 mV, oder das Tier sollte nicht verwendet werden. Sporadische Miniatur Endplatte Potenziale sollten jetzt sichtbar sein. Lassen Sie die Zelle für eine Minute, bevor die Aufnahme zu stabilisieren. </li><li> Änderungen in Membranpotential sind mit einem Axon HS-2A Kopf Bühne und ein Axoclamp 2B Verstärker erfasst und aufgezeichnet mit CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Die Axoclamp 2B ist eine Schnittstelle mit einem Computer, pCLAMP Software und arbeitet in Verbindung mit dem Digidata 1322a-Schnittstelle läuft. </li><li> Die Zellen wurden für 3 Minuten ohne Stimuli zu mEJP Reaktionen messen aufgezeichnet. Die Spuren wurden mit Mini-Analyse-Software (Synaptosoft, v 6.0.3) und die mEJP Amplitude und Frequenz bestimmt. </li></ol> Nerve Stimulation: <ol><li> Der abgetrennte Ende des motorischen Neurons ist mit einer Reihe von quadratischen Spannungsimpulse (0,3 ms Dauer) mit einer Intensität, die ausreicht, sowohl Motor Axone, um konsistente Antworten in der gesamten Muskulatur hervorrufen wird angeregt. </li><li> Der Reiz wird mit dem Master-8 Impulsgeber, die so programmiert werden, Impulse kontinuierlich liefern je nach Dauer und Intervall-Zeiten generiert. </li><li> Lassen Sie fünf Sekunden zwischen Stimuli für die synaptische Erholung an der NMJ. </li><li> Bei der Bestimmung der Stärke des Reizes, mit der untersten Ebene beginnen und die Intensität langsam über mehrere Studien. Die minimale Reizstärke, die in einem evozierte Ergebnisse sollten in Experimenten verwendet werden. </li><li> Wenn die entsprechende Reizintensität erreicht ist, sollte es eine Verbindung EJP und eine Muskelkontraktion durch den Reiz hervorgerufen werden. </li><li> Rekord mindestens 10 evozierte Potentiale aus jeder Muskel und der Mittelwert der Amplituden. </li></ol> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="Abbildung 3" width="600" height="358" /> Abbildung 3. Representative intrazelluläre Aufnahme von Muskel-6, welche die evozierten EJP das ist Reaktion auf elektrische Stimulation der segmentalen Nerven, und die sporadischen Miniatur-Endplatten Potentialen oder mEJP ist. EJP Amplituden im Muskel 6 von gesunden Wildtyp-Larven, wie Canton S, sind in der Regel um 40 mV und die mEJP Amplituden zwischen 1-3 mV.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

Die hier beschriebenen Methoden eine relativ schnelle und breite Weg, um Veränderungen der synaptischen Funktion an der NMJ erkennen. Die Fähigkeit zur elektrophysiologischen Ableitungen mit intakten Tieren in vivo durchzuführen, und führen genetische oder pharmakologische Manipulationen machen Drosophila ein ideales Tiermodell zur Untersuchung der physiologischen und genetischen Aspekte der Neurotransmission. Da Muskelzellen sehr groß sind, könnten einige es vorziehen, einen weiteren ...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>1008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>475002-9902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light for microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott</td>
<td>KLI500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pClamp 9 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>PCLAMP 9 STANDARD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont SS Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>1B120F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette polisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishiga</td>
<td>MF-83</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axon HS-2A head stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>Model HS-2A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axoclamp 2B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>AXOCLAMP 2B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clampex Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>v 8.2.0.235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini analysis software. v 6.0.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Synaptosoft</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brownlee Precision Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brownlee</td>
<td>Model 410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baker</td>
<td>4058-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>p-9333 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>s6297-1kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trelahose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>TO167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>bp220-212 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>h-3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl-6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>m2670-1kg </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>c79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Master-8 Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.M.P.I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration table for electrophysiology set up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical manufacturing corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Faraday Cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

In diesem Video, beschreiben wir die elektrophysiologischen Methoden zur Erfassung der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse (NMJ) von Drosophila Larve. Die Larven neuromuskuläre System ist ein Modell Synapse für das Studium der synaptischen Physiologie und Neurotransmission und ist eine wertvolle Recherche-Tool, dass die Genetik definiert und ist zugänglich für experimentelle Manipulation. Die Larven können seziert, um den Körper Wand Muskulatur, zentrales Nervensystem und der peripheren Nerven freizulegen. Die Muskeln von Drosophila und ihre Innervationsmuster sind gut charakterisiert und Muskeln sind leicht zu intrazelluläre Aufnahme zuzugreifen. A7 - Einzelne Muskeln können durch ihre Lage und Orientierung innerhalb der 8 Abdominalsegmente mit je 30 Muskeln in ein Muster, das in Segmente A2 wiederholt angeordnet identifiziert werden. Dissected Drosophila-Larven sind dünn und einzelnen Muskeln und Bündeln von Motoneuronen Axone können visualisiert werden Durchleuchtung<sup&gt; 1</sup&gt;. Transgene Konstrukte können verwendet werden, um Zielzellen für die visuelle Identifizierung oder zur Manipulation von Genprodukten in bestimmten Geweben zu kennzeichnen. In Larven, sind exzitatorische Kreuzung Potentiale (EJPs) in Reaktion auf vesikuläre Freisetzung von Glutamat aus den Motoneuronen an der Synapse erzeugt. In seziert Larven können die EJP in den Muskel mit einer intrazellulären Elektrode aufgezeichnet werden. Aktionspotenziale können künstlich in Motoneuronen, die ausgeschnitten hinter der Bauchganglion, gezeichnet in eine Glaspipette durch sanfte Saugwirkung und angeregt mit einer Elektrode hervorgerufen werden. Diese motorischen Neuronen haben unterschiedliche Schwellenwerte feuern, wenn er stimuliert, und wenn sie gleichzeitig feuern, erzeugen sie eine Antwort in den Muskel. Signale über die NMJ Synapse übertragen können in den Muskeln, die die motorischen Neurone innervieren aufgezeichnet werden. Die EJPs und Miniatur-erregenden Kreuzung Potentiale (mEJPs) werden als Änderungen in Membranpotential gesehen. Elektrophysiologische Reaktionen sind bei Raumtemperatur in modifizierter minimal Hämolymphe-like-Lösung aufgenommen<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3), die 5 mM Mg enthält<sup&gt; 2 +</sup&gt; Und 1,5 mM Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. Änderungen in der Amplitude der evozierten EJPs können auf Unterschiede in der synaptischen Funktion und Struktur. Digitalisierte Aufnahmen sind für EJP Amplitude, Frequenz und Amplitude mEJP und quantal analysiert.

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Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Aufrufe.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Serie: Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection der Imaginalscheiben vom 3. Instar Drosophila-Larven

Forschung

Biologie

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

Historische Ansicht und Physiologie Demonstration am NMJ der Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...