Vor Beginn der Vorbereitung: <ul><li> Wandering yhird instar Drosophila-Larven </li><li> HL3.1 (Modified Hämolymphe-like)-Lösung </li><li> Sylgard (transparent Silikon-Kautschuk) Dissektion Platten in kleine (35 x 10 mm) Kunststoff-Petrischalen mit Methoden von Brent und McCabe (2008) 3 beschriebenen Verfahren hergestellt. </li><li> Cut Dissektion Stifte kurz </li><li> Stimulationselektrode Pipetten </li><li> Sharp Aufnahme Pipetten </li></ul> HL3 Lösung: <ol><li> 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 Trehalose, 115 Saccharose und 5 HEPES, pH 7,2: Während Dissektionen und elektrophysiologischen Experimenten werden Larve in HL3.1 Lösung 2, die (in mM) enthält, eingetaucht. </li><li> Die Konzentrationen von CaCl 2 sind die HL3.1 Lösung für die erforderliche Konzentration von extrazellulärem Ca 2 + zu addieren. <ul><li> Larven Dissektionen sind bei niedrigen Ca 2 +-Konzentrationen (die Muskelkontraktion zu vermeiden) mit HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, auf Eis gehalten durchgeführt. </li><li> Elektrophysiologische Experimente sind in der Regel in HL3.1 aufgezeichnet + 1 mM CaCl 2, aber das kann von 0,4 eingestellt werden - 1 mM Ca 2 + als erforderlich. </li></ul></li><li> Die Lösung ist HL3.1 Filter vor dem Gebrauch sterilisiert und bei 4 ˚ C. </li></ol> Vorbereitung der anregenden und Aufnahme Pipetten: <ol><li> Heat = 390, Filament = 4, Velocity = 35, Delay = 200 und Pull = 0:. Recording und anregende Pipetten sind mit einem Sutter P-2000 Laser basiert Mikropipette Abzieher mit den folgenden Einstellungen gezogen </li><li> Stimulationselektroden sind aus dünnwandigen Kapillaren aus Borosilikatglas mit breiten Enden, die etwas größer als die Breite der abgetrennten Motor Axone wurden vorbereitet. Die geformten Enden firepolished zu einer glatten Oberfläche (mit einer Pipette Narashiga Polierer), um Schäden an den Nerven zu minimieren geben. Stimulationselektroden sind ausgestattet mit Bad-Lösung (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +) gefüllt. </li><li> Die Aufnahme Elektroden sind aus 1,2 mm Borosilikatglas, das gezogen wird, um eine scharfe Pipette (30-60 mW) zu bilden, und mit 3M KCl vorbereitet. </li></ol> Teil 1: Präparation des Drosophila-Larven <ol><li> Drittens instar wandernde Larven werden seziert, um die Muskeln im Körper Wand freizulegen, wie beschrieben bisher 4. </li><li> Dissektionen sind in HL3.1 durchgeführt + 0,25 mM Ca 2 + auf kleinen Silikon-Platten (35 x 10 mm). HL3.1 Lösung muss eiskalten für Dissektionen werden, um die Larve zu betäuben, und ist auf dem Eis vor und während der Sektionen gehalten. </li><li> Die Larven werden seziert mit Methoden von Brent und McCabe (2008), dass für die Elektrophysiologie Experimenten durch Zugabe von 0,25 mM Ca 2 + auf die HL3.1 Dissektion Lösung, und mit kurzen Dissektion Pins (~ 2 mm in der Länge), die weniger verändert wird beschrieben wahrscheinlich das Mikroskop-Objektiv und Elektroden während eines Experiments getroffen. </li><li> Nach Dissektion, sind der Motor Axone der Larven durchtrennt. Dies wird durch leichtes Halten des ZNS und erhöhen sie leicht, so dass die peripheren Nerven, die die Muskeln hinter dem Bauchganglion innervieren, ohne die Muskeln (Abbildung 1) geschnitten werden kann getan. Das Gehirn wird dann entfernt. </li><li> Die seziert Larven Vorbereitung wird zweimal mit HL3.1 gewaschen + 1 mM Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritte bei der Reduzierung der Motor Axone seziert Larven beteiligt. Das ZNS ist mit einer Pinzette angehoben und der Motor Axone sind an der Basis des Gehirns geschnitten. Teil 2: Intrazelluläre Aufnahme von Larven Muskelzellen. <ol><li> Legen Sie die Dissektion Platte auf der Elektrophysiologie Mikroskop und tauchen prep mit HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + und fixieren Badelektrode so dass es in Kontakt mit der Lösung ist. </li><li> Alle Experimente sind auf Muskel-6 innerhalb der dritten Abdominalsegment (A3) durchgeführt. Periphere Nerven, die die Muskeln innervieren angeregt mit einem Saug-Elektrode 5. </li><li> Position der stimulierenden Elektrode in die Schüssel ersten Erschütterungen zu vermeiden, wenn die intrazelluläre Elektrode vorhanden ist. Setzen Sie den stimulierenden Elektrode in unmittelbarer Nähe des motorischen Neurons innervieren einen Muskel 6 und gelten sanfte Saugwirkung, bis der Schnitt Nerv im Inneren der Glaspipette. Achten Sie darauf, nicht auf die Nerven dehnen, wenn Saug angewendet wird. Heben Sie die Pipette etwas so ist es nicht berühren, die Muskel-und positionieren Sie es, damit es nicht zieht sich auf den Schnitt Nervenfasern (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="Abbildung 2" width="600" height="296" /> Abbildung 2. Eine schematische Darstellung der Muskulatur und innervieren Motoneuronen eines Abdominalsegment aus der Drosophila Larve. Die Position des anregenden Pipette und durchtrennten Nerven und die Aufnahme Elektrode in Position Muskel 6 sind dargestellt. </li><li> Intrazellulären Aufnahmen sind mit scharfen Mikroelektroden mit 3 M KCl gefüllt. Position der Aufnahme-Elektrode oberhalb des Zentrums von Muskel-6 auf dem dritten Abdominalsegment (A3) und stellen Sie die Eingangs-Offset so dass es Null für die Badlösung liest. Langsam senken die Elektrode und Ansatz des Muskels unter hohem optischen Vergrößerung, bis er den Muskel Oberfläche berührt. Sehen Sie sich das Oszilloskop, um zu bestätigen, dass der Muskel wurde durchbrochen. Das Ruhemembranpotential sollte mindestens -60 mV, oder das Tier sollte nicht verwendet werden. Sporadische Miniatur Endplatte Potenziale sollten jetzt sichtbar sein. Lassen Sie die Zelle für eine Minute, bevor die Aufnahme zu stabilisieren. </li><li> Änderungen in Membranpotential sind mit einem Axon HS-2A Kopf Bühne und ein Axoclamp 2B Verstärker erfasst und aufgezeichnet mit CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Die Axoclamp 2B ist eine Schnittstelle mit einem Computer, pCLAMP Software und arbeitet in Verbindung mit dem Digidata 1322a-Schnittstelle läuft. </li><li> Die Zellen wurden für 3 Minuten ohne Stimuli zu mEJP Reaktionen messen aufgezeichnet. Die Spuren wurden mit Mini-Analyse-Software (Synaptosoft, v 6.0.3) und die mEJP Amplitude und Frequenz bestimmt. </li></ol> Nerve Stimulation: <ol><li> Der abgetrennte Ende des motorischen Neurons ist mit einer Reihe von quadratischen Spannungsimpulse (0,3 ms Dauer) mit einer Intensität, die ausreicht, sowohl Motor Axone, um konsistente Antworten in der gesamten Muskulatur hervorrufen wird angeregt. </li><li> Der Reiz wird mit dem Master-8 Impulsgeber, die so programmiert werden, Impulse kontinuierlich liefern je nach Dauer und Intervall-Zeiten generiert. </li><li> Lassen Sie fünf Sekunden zwischen Stimuli für die synaptische Erholung an der NMJ. </li><li> Bei der Bestimmung der Stärke des Reizes, mit der untersten Ebene beginnen und die Intensität langsam über mehrere Studien. Die minimale Reizstärke, die in einem evozierte Ergebnisse sollten in Experimenten verwendet werden. </li><li> Wenn die entsprechende Reizintensität erreicht ist, sollte es eine Verbindung EJP und eine Muskelkontraktion durch den Reiz hervorgerufen werden. </li><li> Rekord mindestens 10 evozierte Potentiale aus jeder Muskel und der Mittelwert der Amplituden. </li></ol> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="Abbildung 3" width="600" height="358" /> Abbildung 3. Representative intrazelluläre Aufnahme von Muskel-6, welche die evozierten EJP das ist Reaktion auf elektrische Stimulation der segmentalen Nerven, und die sporadischen Miniatur-Endplatten Potentialen oder mEJP ist. EJP Amplituden im Muskel 6 von gesunden Wildtyp-Larven, wie Canton S, sind in der Regel um 40 mV und die mEJP Amplituden zwischen 1-3 mV.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

Die hier beschriebenen Methoden eine relativ schnelle und breite Weg, um Veränderungen der synaptischen Funktion an der NMJ erkennen. Die Fähigkeit zur elektrophysiologischen Ableitungen mit intakten Tieren in vivo durchzuführen, und führen genetische oder pharmakologische Manipulationen machen Drosophila ein ideales Tiermodell zur Untersuchung der physiologischen und genetischen Aspekte der Neurotransmission. Da Muskelzellen sehr groß sind, könnten einige es vorziehen, einen weiteren ...

<table><tbody><tr><td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td><td>BD Biosciences</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>475002-9902</td><td></td></tr><tr><td>Light for microscope</td><td>Schott AG</td><td>KLI500</td><td></td></tr><tr><td>Dissection pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 9 software</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 9 STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-0</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette polisher</td><td>Narishige International</td><td>MF-83</td><td></td></tr><tr><td>Axon HS-2A head stage</td><td>Molecular Devices</td><td>Model HS-2A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Axoclamp 2B amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>AXOCLAMP 2B</td><td></td></tr><tr><td>Clampex Software</td><td>Molecular Devices</td><td>v 8.2.0.235</td><td></td></tr><tr><td>Mini analysis software. v 6.0.3</td><td>Synaptosoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brownlee Precision Amplifier</td><td>Brownlee</td><td>Model 410</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker/VWR</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6297-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Trelahose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TO167</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp220-212</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>h-3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>m2670-1kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>c79-500</td><td></td></tr><tr><td>Master-8 Pulse Generator</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibration table for electrophysiology set up</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

In diesem Video, beschreiben wir die elektrophysiologischen Methoden zur Erfassung der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse (NMJ) von Drosophila Larve. Die Larven neuromuskuläre System ist ein Modell Synapse für das Studium der synaptischen Physiologie und Neurotransmission und ist eine wertvolle Recherche-Tool, dass die Genetik definiert und ist zugänglich für experimentelle Manipulation. Die Larven können seziert, um den Körper Wand Muskulatur, zentrales Nervensystem und der peripheren Nerven freizulegen. Die Muskeln von Drosophila und ihre Innervationsmuster sind gut charakterisiert und Muskeln sind leicht zu intrazelluläre Aufnahme zuzugreifen. A7 - Einzelne Muskeln können durch ihre Lage und Orientierung innerhalb der 8 Abdominalsegmente mit je 30 Muskeln in ein Muster, das in Segmente A2 wiederholt angeordnet identifiziert werden. Dissected Drosophila-Larven sind dünn und einzelnen Muskeln und Bündeln von Motoneuronen Axone können visualisiert werden Durchleuchtung<sup&gt; 1</sup&gt;. Transgene Konstrukte können verwendet werden, um Zielzellen für die visuelle Identifizierung oder zur Manipulation von Genprodukten in bestimmten Geweben zu kennzeichnen. In Larven, sind exzitatorische Kreuzung Potentiale (EJPs) in Reaktion auf vesikuläre Freisetzung von Glutamat aus den Motoneuronen an der Synapse erzeugt. In seziert Larven können die EJP in den Muskel mit einer intrazellulären Elektrode aufgezeichnet werden. Aktionspotenziale können künstlich in Motoneuronen, die ausgeschnitten hinter der Bauchganglion, gezeichnet in eine Glaspipette durch sanfte Saugwirkung und angeregt mit einer Elektrode hervorgerufen werden. Diese motorischen Neuronen haben unterschiedliche Schwellenwerte feuern, wenn er stimuliert, und wenn sie gleichzeitig feuern, erzeugen sie eine Antwort in den Muskel. Signale über die NMJ Synapse übertragen können in den Muskeln, die die motorischen Neurone innervieren aufgezeichnet werden. Die EJPs und Miniatur-erregenden Kreuzung Potentiale (mEJPs) werden als Änderungen in Membranpotential gesehen. Elektrophysiologische Reaktionen sind bei Raumtemperatur in modifizierter minimal Hämolymphe-like-Lösung aufgenommen<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3), die 5 mM Mg enthält<sup&gt; 2 +</sup&gt; Und 1,5 mM Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. Änderungen in der Amplitude der evozierten EJPs können auf Unterschiede in der synaptischen Funktion und Struktur. Digitalisierte Aufnahmen sind für EJP Amplitude, Frequenz und Amplitude mEJP und quantal analysiert.

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Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Aufrufe.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Serie: Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Forschung

Neurowissenschaften

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Biologie

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Elektrophysiologische Aufnehmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Geschmack Sensillen

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) Quantification: A Method to Assess Synaptic Morphology and Function

Source: Castells-Nobau, A., et al. <a href="https://www.jove.com/video/55395/" target="_blank">Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology</a>. J. Vis. Exp. (2017).
The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is used as a model to study the morphology and function of synapses. This video describes important features that researchers quantify to characterize the NMJ. The example protocol demonstrates a software able to perform the quantification automatically.

Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Verbindung (NMJ): Eine Methode zur Beurteilung der synaptischen Morphologie und Funktion

Source: Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. ...

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster

Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Elektrophysiologische Aufnehmen von

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Verbindung (NMJ): Eine Methode zur Beurteilung der synaptischen Morphologie und Funktion