Unterstützt von der University of Kentucky, Department of Biology, Office of Undergraduate Studies and College of Arts &amp; Sciences.

Membrane Potential Bereits 1902 wurde Bernstein mit den Themen ein Ruhepotential in das Axon eines Tintenfisches zu tun haben. Es ist faszinierend, zu prüfen, wie diese frühen Ideen und Beobachtungen Berstein (1902) und Nernst (1888) später in der Forschung Membran Physiologie beeinflusst. (Siehe Überprüfung durch Malmivuo und Plonsey, 1995; auch auf der www <a href="http://www.bem.fi/book/">http://www.bem.fi/book/</a> ). Es sind noch bis zum heutigen Tag, Durchbrüche zu über Ionenkanal-Funktion und Eigenschaften von biologischen Membranen, die sehr bedeutsam für das Verständnis der zellulären Physiologie, welche die Funktion von Geweben, Organen und Systemen bezieht gemacht werden. Der Vergleich der experimentellen und theoretisch abgeleiteten Auswirkungen externer [K +] auf das Ruhemembranpotential zeigt den Einfluss der Ionen auf das Membranpotential. Weitere Experimente mit dem gleichen Präparat bleiben durchgeführt werden, um grundlegende physiologische Fragen anzugehen. Einige waren im Jahr 1968 von Atwood und Parnas hervorgehoben und sind noch nicht vollständig gelöst werden. Mit den Techniken in dieser Übung erhalten, kann man vorgehen, um viele Fragen noch in anderen experimentellen Präparaten sowie in physiologischen Anwendungen im Zusammenhang mit Medizin und Gesundheit zu beantworten. Wir haben den Nutzen eines Modells wirbellosen Vorbereitung auf grundlegende Fragen relevant für alle Tiere-Adresse gezeigt. Mit den Kenntnissen über die elektrochemischen Gradienten von Ionen in diesem oben genannten Übung können Sie jetzt auf die Erregbarkeit der Membranen Voraus durch die Untersuchung der synaptischen Übertragung auf neuromuskuläre Präparate in der Krebse. Messen Synaptic Responses Die Details für den ersten Teil dieses Labors, und die damit verbundenen Film zur Verfügung gestellt haben wichtige Schritte für die Aufnahme Membranpotentiale und Untersuchung von Muskel-Struktur zur Verfügung gestellt. Im zweiten Teil dieses Labors, sofern der Nachweis einer Dissektion und Aufnahme synaptischen Übertragung im NMJs der phasischen und tonischen motorischen Einheiten ein Engagement in grundlegende Konzepte in der Physiologie. Die Exposition gegenüber einem neuronalen Schaltkreis, der in Teil kann kann man damit verbundenen Verhaltensweisen im intakten Tier erklären, hat das Potenzial nicht nur für Studenten, um verschiedene offene Fragen im Rahmen ihrer Laborübung zu untersuchen, sondern auch für die zukünftige Forschung auf neuronale Schaltkreise in einem gut gegründet wirbellosen Vorbereitung (Kennedy et al, 1969;. Antonsen und Edwards, 2003) Diese Präparate können auch zur synaptischen Erleichterung, Depressionen und langfristige Plastizität (die nicht in dieser Laborstudie untersucht) zu untersuchen. Selbst innerhalb einiger Arten von Krebsen, hängt neuronalen Plastizität auf den experimentellen Stimulation Bedingungen (Mercier und Atwood, 1989;. Cooper et al, 1998) sowie ihrer natürlichen Umgebung. Inwieweit die Fähigkeit zur synaptischen Wirksamkeit und Muskel Dynamik verändern dient das Tier bleibt zu untersuchen. Da Krebse ändern ihr Verhalten in Bezug auf saisonale Schwankungen und die Häutung Zyklus zu tun, gibt es relativ langfristige Tätigkeit Unterschiede in ihrer neuromuskulären Systems. Es hat sich gezeigt, dass die phasischen motorischen Nervenenden der Kralle näher Muskeln der klassischen phasischen Morphologie weisen im Winter, sondern anschwellen und mehr Krampfadern entlang der Länge des Terminals während der Sommermonate (Lnenicka 1993; Lnenicka und Zhao, 1991). Einige frühe Studien in Flusskrebse seitlichen Riese (LG) Interneuronen im Bauchmark durchgeführt wurde, zeigte die Anwesenheit von Gap Junctions (Johnson, 1924; Watanabe und Grundfest, 1961). Es ist bekannt, dass CO 2 eine Auswirkung auf elektrische Kommunikation durch Abkoppeln Gap Junctions (Arellano et al, 1990) hat. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Nervenstrang und die Kommunikation innerhalb der sensorischen-CNS-motor-Muskel-Schaltung, wie in diesem Bericht beschrieben, ist auch empfindlich auf 2-Exposition CO, auf das Vorhandensein von Gap Junctions (Bierbower, 2010; Bierbower und Cooper, 2010) Die spontane Aktivität der 3 rd motorische Wurzel hat ein Thema seit den 1960er Jahren, als Eckert (1961), wenn die Tonika Brennen statischen Muskel-Rezeptor-Orgel (MRO) in der gleichen oder benachbarten Segment für die spontane Antrieb Konto konnte untersucht. In diesen früheren Studien zeigte sich, dass die Aktivität im ventralen Nervenstrang (VNC) wurde möglicherweise von höheren Zentren (Eckert, 1961; Kennedy und Takeda, 1965a, b;. Strawn et al, 2000) angetrieben. Da die Anwesenheit von CO 2 stoppte die spontane Aktivität, kann man irgendwo in der Antrieb auf die Motoneuronen nehme an, es könnte Gap Junctions oder glutamatergen exzitatorischen Laufwerk sein. Die NMJs blockiert oder weisen verminderte Sensitivität gegenüber der in Gegenwart von CO 2 Glutamat, und sie können bloc werdensowie innerhalb des ZNS ked (Bierbower, 2010; Bierbower und Cooper, 2010; siehe auch Badre et al, 2005.). Die Wirkung verschiedener Neuromodulatoren ist auch leicht an die verschiedenen Arten von NMJs (; Griffis et al, 2000;. Southard et al, 2000;.. Strawn et al, 2000 Cooper und Cooper, 2009) untersucht. Darüber hinaus sind verschiedene Einflüsse von Neuromodulatoren auf das ZNS Schaltung ausgeübt. Es wurde vorgeschlagen, dass die 5-HT und Oktopaminerge Neuronen kann als &quot;Gewinn-Setter&quot; in der Veränderung der Ausgang des neuronalen Schaltkreisen (Ma et al, 1992 Funktion;. Schneider et al, 1996;. Hörner et al, 1997;. Edwards et al., 2002). Es bleibt noch viel zu tun, bevor wir völlig verstehen kann, die Auswirkungen von Neuromodulatoren auf einzelne Zielzellen. Da die verschiedenen Neuromodulatoren können in Absprache mit den anderen zusammenzuarbeiten, ist die Analyse ihrer gemischten Aktion ein Bereich für die zukünftige Forschung (Djokaj et al., 2001). Darüber hinaus nur wenige Studien, vor allem in der Wirbeltiere, die Auswirkungen der Neuromodulatoren auf dem gesamten Wege, die ein bestimmtes Verhalten regulieren können. In diesem sinnlich-CNS-Motor-Einheit Vorbereitung kann man den Einfluss der beiden sensorischen Input und Neuromodulatoren auf die Aktivität der Motoneuronen (Kennedy et al., 1969). Da es postuliert hat, dass 5-HT eine Rolle spielt bei der Regulierung des Verhaltens Zustand der Krebse, Hummer und Krabben (Livingstone et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000) wurden mehrere Versuche unternommen, um seine Konzentration zu bestimmen, die VNC, der Hämolymphe und in isolierten Ganglien Hummer (Livingstone et al, 1980;. Harris-Warrick und Kravitz 1984;. Fadool et al, 1988). Allerdings gab es erhebliche Unterschiede in den aufgezeichneten Messungen ausschließen spezielle Dosis-Wirkungs-Beziehungen, die für Verhaltensstörungen Aktionen verantwortlich sein könnten. Ein Flusskrebs mit den Klauen in einer erhöhten Position und mit dem Schwanz unter seinem Bauch versteckt gehalten wurde gedacht, um eine dominieren Haltung aufweisen (Livingstone et al., 1980). Der Zustand der Bauch-Flexion in Krebsen scheint nicht die Haltung, dass dominante Krebse, innerhalb eines Paares, während die sozialen Interaktionen aufweisen oder unter Beibehaltung eines dominierenden hierarchischen Status (Listerman et al., 2000). Devot Krebse wird auch tuck ihren Bauch unter sich, wie sie Rückzug von einem Gegner. Solche Schwanz stopfte wird auch als eine Abwehrhaltung (Listerman et al., 2000) gesehen. Diese Verhaltensweisen wurden leicht im Feld und im Labor Einstellungen beobachtet (Bovbjerg, 1953, 1956; Bruski und Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). Interessanterweise stellte die Verhaltens-Haltungen in Hummer (Livingstone et al., 1980) sind für die 5-HT und Octopamin Injektionen in die australische Flusskrebse, Cherax destructor (McRae, 1996) umgekehrt. Möglicherweise würden ganz unterschiedliche Reaktionen in der oberflächlichen Beuger Vorbereitung in der australischen Krebse beobachten. Darüber hinaus, da Dominanz ist in der Regel eine Größe zwischen Krebsen verwandt, würde man erwarten, eine sehr plastische Antwort-System für die schnelle veränderten gesellschaftlichen Bedingungen (Strawn et al., 2000). Die Plastizität in Reaktion auf Neuromodulatoren in wirbellosen Tieren ist ein offenes Forschungsgebiet. Wyttenbach, Johnson und Hoy (1999) haben digitale Medien und ein Labor Anleitung für verschiedene Krebse Experimente mit den gleichen Muskel in diesem Bericht neben anderen Krebse Vorbereitungen vorgestellt produziert. Dies ist eine hervorragende Ressource für Schüler Übungen.

<ol><li> Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard-Krebse Kochsalzlösung: Geändert von Van Harreveld-Lösung (1936). (In mm) 205 NaCl, 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES und auf pH 7,4 eingestellt. Serotonin, Glutamat und Dopamin sind in Flusskrebse Kochsalzlösung. Bouin Fixierlösung wurde direkt und verwendet Methylenblau ist in Flusskrebse Kochsalzlösung hergestellt. Alle Chemikalien sind von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten. </li><li> Dissection-Tools: Fine Nr. 5 Pinzette, feine Schere, Messer Messerhalter, # 26002-20 Insektennadeln (alle von Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139 erhalten) . </li><li> Sylgard-Talsohle Glasschale </li><li> Becher (gegenüber chemischen Lösungen halten) </li><li> Elektrische Signale werden auf Linie zu einem PowerLab 26T-Schnittstelle an einen Computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) aufgezeichnet. Wir verwenden Standard-Software von ADInstruments namens Chart-oder Scope. </li><li> Modell 3000 AC / DC-Verstärker für die intrazelluläre als auch extrazelluläre Aufnahmen verwendet werden kann. </li><li> Präpariermikroskop mit Zoom-Funktion für die intrazelluläre Aufnahme. Für fokale Aufnahme auf visualisiert Terminals ein zusammengesetztes Mikroskop mit aufrechten Ziele (4 x und 20x) verwendet wird. Man braucht eine Hg-Lichtquelle. </li><li> Für intrazelluläre Ableitungen verwenden wir Glaskapillare Schlauch (Katalog # 30-31-0 von FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). Die intrazelluläre Elektrode sollte einen Widerstand von 20 bis 30 mOhm. Intrazelluläre Elektroden wurden mit 3 M KCl gefüllt. </li><li> Ein Saugelektrode wird verwendet, um extrazelluläre Signale aufzuzeichnen. </li><li> Faraday-Käfig. </li><li> High Intensity Illuminator (Lichtquelle). </li><li> Mikromanipulator </li></ol>

membrane potentials, synaptic responses, neuronal circuitry, neuromodulation and muscle histology using the crayfish: student laboratory exercises

Der Zweck dieses Berichts ist es, ein Verständnis der Auswirkungen von Ionengradienten über eine biologische Membran verursacht. Zwei Aspekte, die eine Zellmembran potenziellen Einfluss und die wir-Adresse in diesen Experimenten sind: (1)-Ionen-Konzentration von K + an der Außenseite der Membran, und (2) die Durchlässigkeit der Membran für bestimmte Ionen. Die Krebse abdominale Streckmuskeln sind in Gruppierungen wobei einige Tonika (langsam) und andere phasische (schnell) in ihren biochemischen und physiologischen Phänotypen, sowie in ihrer Struktur, die Motoneuronen, dass diese Muskeln innervieren sind entsprechend unterschiedlich in funktionellen Eigenschaften. Wir benutzen diese Muskeln sowie die oberflächliche, Tonic abdominale Beugemuskeln, um die Eigenschaften der synaptischen Übertragung zu demonstrieren. Darüber hinaus führen wir eine sinnlich-CNS-Motoneuronen-Muskel-Schaltung, um die Wirkung der Kutikula sensorische Stimulation wie auch der Einfluss der Neuromodulatoren über bestimmte Aspekte der Schaltung zu demonstrieren. Mit den Techniken in dieser Übung erhalten, kann man anfangen zu viele Fragen noch in anderen experimentellen Präparaten sowie in physiologischen Anwendungen im Zusammenhang mit Medizin und Gesundheit zu beantworten. Wir haben den Nutzen des Modells wirbellosen Vorbereitungen auf grundlegende Fragen relevant für alle Tiere-Adresse gezeigt.

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Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

Die Experimente zeigen, eine einfache Möglichkeit für Studenten, um Erfahrungen bei der Prüfung Muskulatur, synaptische Antworten, die Auswirkungen der Ionengradienten und Durchlässigkeit auf Membranpotentiale zu gewinnen. Auch ist ein sinnlich-ZNS-motor-Muskel-Schaltung vorgestellt, um ein Mittel, um Wirkungen von Verbindungen auf einem neuronalen Schaltkreis-Test zeigen.

Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

membrane-potentials-synaptic-responses-neuronal-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

58.4K Aufrufe.  University of Kentucky. Die Experimente zeigen, eine einfache Möglichkeit für Studenten, um Erfahrungen bei der Prüfung Muskulatur, synaptische Antworten, die Auswirkungen der Ionengradienten und Durchlässigkeit auf Membranpotentiale zu gewinnen. Auch ist ein sinnlich-ZNS-motor-Muskel-Schaltung vorgestellt, um ein Mittel, um Wirkungen von Verbindungen auf einem neuronalen Schaltkreis-Test zeigen.

Serie: Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Recording Verhaltensreaktionen auf Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Forschung

Neurowissenschaften

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Muscle-Rezeptor-Organe in der Crayfish Abdomen: Ein Schülerlabor Übung in Propriozeption

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings with a force transducer to monitor the strength of contraction. In addition, we demonstrate how to visually monitor peristaltic activity, which can be used as a bioassay for various peptides, biogenic amines and neurotransmitters. This preparation is amenable to student laboratories in physiology and for demonstrating pharmacological concepts to students. This preparation has been in use for over 100 years, and it still offers much as a model for investigating the generation and regulation of peristaltic rhythms and for describing the mechanisms underlying their modulation. The pharmacological assays and receptor sub-typing that were started over 50 years ago on the hindgut still contribute to research today. This robust preparation is well suited to training students in physiology and pharmacology.

In this report we demonstrate techniques that can be used to investigate the biology of the crayfish hindgut. We show how to dissect a crayfish abdomen and study the associated anatomy, physiology and modulation of activity. The peristaltic activity and strength of contractions are measured using a force transducer.

Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Akut<em&gt; In vivo</em&gt; Elektrophysiologische Aufzeichnungen von lokalen Feldpotentialen und Multi-Unit-Aktivitäten von der Hyperdirect-Pathway in anästhesierten Ratten

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...