Die Autoren danken Dr. James Bamburg und Mitglieder seines Labors für die Zusammenarbeit in diesen Studien. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt HD19950, EY07133 und durch Zuschüsse aus dem Minnesota Medical Foundation finanziert.

Für Rhodamin-Aktin Kennzeichnung, sind Neurone auf Deckgläschen in den Boden 35 mm Kunststoff-Schalen gelegt, oder auf Deckgläschen in &quot;video&quot; Gerichte geklebt kultiviert. 1. Vorbereitung der Deckgläser oder &quot;Video&quot; Dishes <ol><li> Viele neuronale Typen sind schlecht Klebstoff in vitro Substrate. Deckgläser, die für dieses Verfahren erforderlich sind, kann nicht genügend Neuron-Substrat-Haftung, sofern sie angemessen gereinigt und aufbereitet. Eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens für den sauren Wasch-und Reinigungsmitteln Deckgläschen wird in dem Buch Kultivierung Nervenzellen, herausgegeben von Banker und Goslin beschrieben. Alternativ ist eine Nitrozellulose-Beschichtung für Deckgläser, die eifrig bindet Substrat-Moleküle, in Stufen 1,7 und 1,8 beschrieben. </li><li> Deckgläser (z. B. 18 mm Quadrate oder 24 mm Kreise) sind in dH 2 O gespült und gebacken in trockene Hitze (≥ 225 ° C) so lange wie möglich (mindestens einige Tage bis zu drei Monaten oder länger), um Spuren von organischen entfernen Verbindungen. Zum 1.6 oder für Video-Gerichte gehen zu 1,3 Schritt. </li><li> So erstellen Sie eine dünne klare Glassubstrat für hochauflösende Videomikroskopie sind kreisrunde Löcher mit entsprechendem Durchmesser in den Boden von 35 oder 50 mm Kunststoff-Petri-oder Gewebekultur-Schalen mit einem elektrischen Korkbohrer (oder ähnliches Instrument) gebohrt. Drilling wird langsam mit leichtem Druck zur Vermeidung von Rissen im Kunststoff gemacht. Die Kanten der Bohrung sind mit einer Schere abgekratzt, um eine glatte Oberfläche auf beiden Seiten zu schaffen. </li><li> Deckgläser für Gewebekultur Gebrauch gereinigt, wie in 1.1 oder 1.2 beschrieben. Deckgläser sind vorhanden über die Löcher geklebt, mit ungiftigen Silikon Aquarium Zement (für 18x18mm Deckgläser, ein 12mm Durchmesser Bit verwendet wird). Der Zement wird für 24 Stunden ausgehärtet. </li><li> (Die folgenden Schritte sind getan mit sterilen Bedingungen) Das Video Gerichte sind 3-mal mit sterilem dH 2 O gespült und an der Luft trocknen lassen. </li><li> Deckgläser werden mit Substrat-Moleküle für neuronale Kultur beschichtet. Zunächst wird die Oberfläche mit Deckglas beschichtet (250 ul für 18x18 Deckglas) eine Lösung von 100 ug / ml Poly-D-Lysin in PBS für 4-8 Stunden (oder über Nacht) in einem befeuchteten 38 ° C Inkubator. Deckgläser werden dann 3 mal mit sterilem dH 2 O gespült, um ungebundene Poly-D-Lysin zu entfernen und an der Luft trocknen lassen. Viele neuronale Typen sind auf Deckgläsern mit Poly-D-Lysin allein beschichtet, wenn die Serum-Proteine ​​in das Kulturmedium enthalten sind kultiviert. Allerdings Ergebnisse relevanter für in vivo-Bedingungen werden mit natürlichen Substrat-Moleküle erhalten. Lösungen dieser Moleküle, wie Laminin, Fibronektin oder L1 CAM (1-20 ug / ml in PBS), können direkt auf Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser für 4-8 Stunden oder über Nacht angewendet werden, aber in unserem Labor haben wir routinemäßig Mantel der vorbereiteten Deckgläser mit einem dünnen Film aus Nitrozellulose, bevor Zelladhäsionsmoleküle, um Protein-Substrat-Bindung zu erhöhen. </li><li> Machen Sie eine 1% Nitrocellulose-Lösung durch Auflösen von 5 g Nitrozellulose in 5 ml 100% Amylacetat. Auftragen von 10 ul dieser Lösung für das Deckglas und sanft verteilen sie über die Oberfläche. Der Luft trocknen lassen 10 Minuten. </li><li> Apply 250 ul einer Lösung von 25 ug / mL Laminin oder 4 ug / ml L1 CAM in PBS und breiten sich über die Nitrozellulose Oberfläche. Inkubieren 4 Stunden (oder über Nacht) in einem befeuchteten 38 ° C Inkubator, absaugen Substrat und sofort Kulturmedium, so das Substrat nicht austrocknet. </li></ol> 2. Vorbereitung der neuronalen Kulturen <ol><li> Embryonale Tag 7 Hühnerembryonen sind aus Eiern entfernt, und in 100 mm Petrischalen mit Kulturmedium mit 10% Serum für die Präparation der inneren Organe aus der Brust und Hinterleib entfernen, mit einem Stereomikroskop. </li><li> Die Embryonen werden dann mit Medium gespült und zog nach einer 60-mm-Schale mit flüssigem Medium und weitere seziert zu entfernen und vorzubereiten Explantate der Spinalganglien (DRG) oder neuronale Retina Gewebe. Methoden und Anwendungen für den Cell-Biologe, von Hollenbeck und Bamburg bearbeitet: Eine ausführliche Beschreibung finden Sie in Dissektion Methods in Cell Biology, Volume 71, Neuronen gefunden werden. DRG Explantate 1/2-whole Ganglien und neuronalen Retina Explantate 1 mm oder weniger im Durchmesser. </li><li> Nach dem Reinigen der Explantate von fremden Geweben sind die einzelnen Explantate mit Uhrmacher Pinzette auf die Deckgläser, die bereits in Kulturschalen mit dem Kulturmedium verschoben. Unter einem Binokular, ist die Explantation sanft in die Mitte des Deckglases mit einer Pinzette, um Bewegung zu verhindern, während Transport in den Inkubator gedrückt. Explantate werden in F12-Medium mit B27 Zusatzstoffe, mit 10 mM HEPES auf pH 7,4 gepuffert und über Nacht in einer feuchten 38 ° C Inkubator gestellt kultiviert. Wachstumsfaktoren können hinzugefügt werden, je nach Bedarf, zum Kulturmedium. Neurotrophine sind oft DRG Kulturen aus älteren Embryonen aufgenommen, obwohl E7 DRG Neuronen Axone aus Explantaten ohne zusätzliche Neurotrophine zu verlängern. Explantate von neuronalen Netzhaut verlängern Axone in diesem Kulturmedium ohnedding Wachstumsfaktoren. </li><li> Die Kulturen werden für mindestens 18 Stunden inkubiert, um eine ausreichende axonalen Auswachsen vor Beginn des Verfahrens unter ermöglichen. </li></ol> 3. Vorbereitung der Rhodamin-Aktin Permeabilisierung Buffer <ol><li> Eine Stammlösung von Permeabilisierung Puffer mit 138 mM KCl, 10 mM PIPES, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2, und 1% BSA (pH = 6,9) kann bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden bei 4 ° C11. Kurz vor Gebrauch werden die folgenden Komponenten für eine Endkonzentration von fügte hinzu: 0,025% Saponin, 0,1 mM ATP und 100 nM Alexa-Fluor 350 Phalloidin. </li><li> Eine separate Lösung ist auch frisch unmittelbar vor Gebrauch mit den gleichen Komponenten plus 0.45 Rhodamin non-muscle actin Die Lösung wird abwechselnd gevortext und tritrated für 5 min auf Rhodamin-Aktin Klumpen auflösen vorbereitet und ist für 1 min während der ersten Permeabilisierung Schritt gevortext zu verhindern Polymerisation in die Röhre. Sollten trotz dieser bleibt Filament Montage in das Rohr ein Problem, kann die Lösung vor zentrifugiert werden, um zu verwenden. </li></ol> 4. Permeabilisierung der neuronalen Kulturen und Einarbeitung von Rhodamin-Aktin auf F-Aktin Barbed Ends <ol><li> Eine Kulturschale mit DRG-oder Retina-Explantaten wird sorgfältig aus dem Brutschrank entnommen und die folgenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. </li><li> Alle Änderungen der Lösungen müssen sorgfältig ausgeführt werden. Die Pipettenspitze sollte am Rande des Deckglases gebracht werden, und Lösungen sollten entfernt und hinzugefügt werden langsam und mit minimalem Kraftaufwand. </li><li> Das Kulturmedium wird mit einer Pipette vorsichtig entfernt, aber stetig, und genug Permeabilisierung Puffer, um Zellen Abdeckung für 1 min (für 18mm x 18mm Deckglas, ~ 60 ul) aufgenommen. Die Kultur ist nicht mit anderen Lösungen vor der Zugabe der Permeabilisierung Puffer gespült, und das Deckglas ist nicht erlaubt, vor der Zugabe der Permeabilisierung Puffer trocken. </li><li> Die Permeabilisierung Puffer vorsichtig mit einer Pipette entfernt und durch die Permeabilisierung Puffer mit 0,45 um Rhodamin non-muscle actin für 4 min. </li><li> Die Rhodamin-Aktin-Puffer wird vorsichtig mit einer Pipette entfernt, und die Neuronen sind fest durch Zugabe einer Lösung von 4% Paraformaldehyd (Laborqualität, machte mit Phosphat-Puffer, pH 7,3), 0,05% Glutaraldehyd und 10% Saccharose. Nach 5 Minuten Fixierung der Deckgläser sind vorsichtig mit PBS gespült und montiert in Slowfade auf 3-Zoll-Glasplättchen. </li><li> Ein alternativer Ansatz zur Veränderung Lösungen ist es, eine Durchflusszelle verwenden. Dies kann ein im Handel erhältliches Durchflusszelle werden, oder eine einfache Durchflusszelle können, indem sie kleine Stücke aus Kunststoff (≤ 1 mm dick) als Abstandshalter an den Ecken des Deckglases gemacht werden, und dann Montage eines gleich großen Deckglas auf der Oberseite des Deckglas. Lösungen können, indem Sie die Pipette an einer Seite der Messzelle und Aberkennung der Lösungen mit einem Docht (Baumwolle oder Kimwipe) auf der anderen Seite ausgetauscht werden. </li><li> Die Aufnahme von Rhodamin-Aktin auf F-Aktin Stacheldraht endet und Fluoreszenz-Phalloidin Kennzeichnung von F-Aktin in Wachstum Kegel visualisiert mit Auflicht-Fluoreszenz-Optik durch ein 60X Ölimmersionsobjektiv und Bilder gesammelt werden, mit einer gekühlten CCD-Kamera. Einem konfokalen Mikroskop kann eine verbesserte Bildgebung. </li><li> Für eine optimale Quantifizierung von Rhodamin-Aktin Einbindung aller Bilder sollten in einer einzigen Sitzung gesammelt werden, mit den gleichen Gewinn und Belichtungseinstellungen der Kamera die Empfindlichkeit für jedes Bild. Die Analyse der Kennzeichnung sollte von entsprechenden Regionen von jedem Bild gemacht werden; Metamorph, Image J oder ähnlichen EDV-Werkzeuge für die Bildanalyse verwendet werden kann. </li></ol> Variationen dieses VERFAHREN 5. Variation One: Collect Live Cell Bilder vor dem Rhodamin-Aktin Labeling <ol><li> Video Gerichte werden auf einer vorgewärmten Mikroskoptisch gelegt, und Live-Wachstum Kegel Bilder gesammelt werden. Gitter und Deckgläser verwendet werden, oder Radierungen und / oder Stift Markierungen auf dem Deckglas gemacht, um leichter zu finden spezifischen Zellen nach der Markierung, oder die Video-Gericht kann in Platz auf dem Mikroskoptisch werden für die Dauer des Verfahrens festgelegt. </li><li> Permeabilisierung der Einbau von Rhodamin-Aktin und Zellfixierung sind in der Video-Gericht durchgeführt, entweder an oder aus dem Mikroskoptisch. Nach der Fixierung wird PBS, um Video Gerichte für die sofortige Bildgebung aufgenommen. Zur Wahrung der Probe für die spätere Bildverarbeitung, ist slowfade Eindeckmedium auf das Deckglas gegeben und ein Deckglas von gleicher Größe ist leicht auf der Oberseite platziert (Vermeidung von Blasen), und die Ränder werden dann mit klarem Nagellack versiegelt. </li></ol> 6. Variation II: Immunochemistry zu Co-label zusätzliche Proteine <ol><li> Rhodamin-Aktin Aufnahme und Fixierung auf Neuronen auf Deckgläsern oder in Video-Schalen kultiviert, durchgeführt werden, wie oben (4,2-4,4) beschrieben. </li><li> Nach der Fixierung und Spülung in PBS werden die Zellen 15 min mit 0,1 M Glycin in PBS behandelt und dann mit 0,1% Triton X-100 (TX-100) in PBS mit 2% Ziegenserum und 1% BSA für 1 h Deckgläsersind mit dem primären Antikörper in PBS verdünnt mit 1% BSA für 1 h inkubiert Die Deckgläser werden dann gespült und in 0,1% TX-100 in PBS mit 2% Ziegenserum und 1% BSA für 1 h, bevor fluoreszierenden Sekundärantikörper bei 1:1000-Verdünnung in PBS mit 1% BSA für 1 h Nach dem Spülen werden die Deckgläschen wieder in 0,1% TX-100 in PBS mit 2% Ziegenserum und 1% BSA für 30 min inkubiert, gespült und montiert in Anti-Fading-Medium. Die Lokalisation einiger Proteine ​​wird durch die ersten Permeabilisierung Schritt (4,3) gestört. Zur Erhaltung dieser Proteine ​​für die Lokalisierung mit Antikörpern, 0,05% Paraformaldehyd und 0,05% Glutaraldehyd kann die Permeabilisierung Puffer für 1 min (dh vor der Zugabe der Rhodamin-Aktin) hinzugefügt, ohne die mit Widerhaken versehene Ende Kennzeichnung von Rhodamin-Aktin. </li><li> Bilder von Triple-markierten Wachstum Kegel sind durch Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie gesammelt. </li></ol> 7. Variation Drei: Beurteilung der Auswirkungen der Guidance Cues auf F-Aktin Freie Barbed Ends <ol><li> Ein Wachstumsfaktor oder Anleitung Cue ist Kulturschalen in den Brutschrank bei Konzentrationen von mehreren ng / mL für ein paar Minuten (oder eine geeignete Behandlung der Zeit) vor dem Entfernen der Schale aus dem Inkubator und dem Beginn der Permeabilisierung Verfahren aufgenommen. Dies ermöglicht eine Beurteilung der kurzfristigen Effekte von Wachstumsfaktoren oder Anleitung Hinweise auf F-Aktin frei Stacheldraht endet. </li><li> Ein Video Schüssel mit neuronalen Kulturen können auf einer erwärmten Objekttisch gelegt werden, und Wachstumsfaktoren oder Anleitung Hinweise können aus einer Mikropipette in ein Gefälle in der Nähe ein Wachstum Kegel vor Beginn der Permeabilisierung und Rhodamin-Aktin Einbau freigegeben werden. Zum Beispiel kann NGF für DRG-Neuronen oder Netrin für neuronale retinalen Ganglienzellen freigegeben werden. Die Pipette kann für so kurz wie 1-2 Minuten vor Beginn der Permeabilisierung Verfahren eingeführt werden. Dies ermöglicht die Beurteilung der lokalen Auswirkungen einer Führung Cue Gradienten auf die Bildung von F-Aktin frei Stacheldraht endet in Wachstum Kegel führenden Margen (siehe Referenz Zitat 10 für Bilder). </li><li> Diese Variationen können mit Antikörper-vermittelten Kennzeichnung von anderen neuronalen Komponenten, wie in 6,2 oben beschrieben kombiniert werden. </li></ol> 8. Variation Four: F-Aktin Freie Barbed End Labeling auf transfizierten Neuronen <ol><li> Die Verwendung von konstitutiv aktiven oder dominant-negative Konstrukte oder Protein Knockdown mittels RNAi (mit einem fluoreszierenden Marker zu identifizieren) können verwendet werden, um ein Protein, das Engagement bei der Regulierung der F-Aktin frei Stacheldraht endet beurteilen. Je nach Protein, dessen Lokalisation im Wachstum Kegel, und wenn es zu einem fluoreszierenden Marker fusioniert ist, die fluoreszierende exprimierten Proteins in transfizierten Zellen können auf Permeabilisierung verloren. Wenn dies der Fall ist, kann Video-Gerichten verwendet werden, um eine transfizierte Zelle mikroskopisch vor Permeabilisierung zu identifizieren, und die Permeabilisierung kann auf dem Mikroskoptisch durchgeführt werden, nach dem Markieren der Positionen der transfizierten Zellen. Alternativ kann ein GFP-Aktin-Konstrukt mit einem Interesse GFP-Konstrukt co-transfiziert werden. In diesem Fall wird GFP-Aktin in F-Aktin einbezogen werden, und wird nicht durch Permeabilisierung verloren werden, so dass die Identifizierung der transfizierten Zellen nach Permeabilisierung. </li><li> Diese Variante kann mit der Zugabe von Leitlinien Cues kombiniert werden, wie in 7,1-7,3 oben beschrieben. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Globale Zugabe von NGF erhöht insgesamt F-Aktin-und F-Aktin Stacheldraht endet am Wachstum Kegel führenden Marge. Wenn ein DRG Wachstum Kegel mit nerve growth factor (NGF) für 5 Minuten stimuliert wird, Aktin-Polymerisation zu den führenden Marge wird angeregt, und ein helles Band von Rhodamin-Aktin Kennzeichnung ist um das Wachstum Kegel Peripherie gesehen. Abbildung 1 vergleicht Rhodamin-Aktin Einbau in ein unstimulierten DRG Wachstum Konus und einem NGF-stimulierten DRG Wachstum Kegel. Die grüne Fluoreszenz in der fusionierten Bilder ist Phalloidin Kennzeichnung für F-Aktin in der Wachstum Kegel und das Rot ist Rhodamin-Aktin Kennzeichnung. Eine gute Kontrolle für die mit Widerhaken versehene Ende Kennzeichnung ist bis 10-6 M oder höher Cytochalasin B oder D in der Permeabilisierung Puffer in Schritten 4.2 und 4.3 hinzugefügt. Cytochalasine cap F-Aktin Stacheldraht endet und hemmen Rhodamin-Aktin-Bindung an Stacheldraht endet. Dies sollte stark reduzieren oder zu eliminieren Aufnahme von Rhodamin-Aktin in der Zelle. Scale-Bars, 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein NGF Gradienten lokal erhöht F-Aktin Stacheldraht endet. Eine Mikropipette dass Freisetzungen NGF auf einer Seite eines DRG Wachstum Kegel für 2 Minuten, durch die Kennzeichnung von F-Aktin frei Stacheldraht endet, gefolgt gebracht wird. Die Bilder unten zeigen, dass die Exposition auf einem Gefälle von NGF lokal stimuliert eine Erhöhung der F-Aktin frei Stacheldraht endet im Wachstum Kegel Region näher an der Pipette. Das fusionierte Bild zeigt Phalloidin in grünund Rhodamin-Aktin in rot. Scale-bar, 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Aktiviert ERM-Proteine ​​akkumulieren an der Wachstumskegel führenden Marge. Immunzytochemische Kennzeichnung phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (Perm) mit F-Aktin frei Stacheldraht endet. Glutaraldehyd (0,05%) und Paraformaldehyd (0,05%) waren die ersten Permeabilisierung Puffer für eine Minute zu ERM Lokalisierung erhalten aufgenommen. Rhodamin-Aktin, rot; PERM, grün; Phalloidin, blau. Scale-bar, 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Stimulation des Aktin-Polymerisation erfordert eine aktive ERM-Proteine. Dissoziierte DRGs wurden mit GFP-Aktin und GFP Kontroll-Plasmid oder eine dominant-negative Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM)-Konstrukt co-transfiziert. Die Verwendung von GFP-Aktin ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen nach Permeabilisierung. Hier wurde NGF 5 min vor der Markierung von F-Aktin Stacheldraht endet aufgenommen. Beachten Sie das Wachstum Kegel mit DN ERM transfizierten hat Widerhaken versehene Ende Ebenen, auf das Wachstum Kegel führenden Rand (untere Mitte), die mit einem in der Nähe untransfizierte Wachstum Kegel (untere Reihe) Kontraste, oder mit dem GFP-Kontrolle (obere Mitte) reduziert. Rhodamin-Aktin, rot; GFP-Aktin, grün. Scale-Bars, 10 pm.

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	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+Understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Letourneau, P., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Pathfinding:+Extracellular+Matrix+Role.">Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).</li><li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touch+and+go:+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton.">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li><li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance.">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li><li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones.">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li><li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li><li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues.">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li><li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor/cofilin.">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li><li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin:+A+functional+node+in+cell+biology.">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li><li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ADF/cofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1.">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li><li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts.">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li><li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells.">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li></ol>

Die hier vorgestellten Methoden erlauben zeitliche und räumliche Auflösung der zellulären Komponenten, die in der dynamischen Umbau des Aktin-Zytoskeletts bei den führenden Marge von Migration Wachstum Kegel beteiligt sind. Die Wirkung von Lockstoff-Moleküle, wie NGF oder Netrin, um schnell zu stimulieren Aktin-Filament-Polymerisation wird als eine lokale Erhöhung der Aktin Stacheldraht endet, von Aktin-Filament-Abtrennung von aktivierten ADF / Cofilin 10 erstellt, wie in den Abbildungen 1 und 2 dargest...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

Die beweglichen Spitzen der wachsenden Axone genannt Wachstum Kegel. Wachstum Kegel führen Navigation Axone durch die Entwicklung von Geweben durch die Interaktion mit lokal ausgedrückt molekulare Orientierung Hinweise, dass das Wachstum Kegel-Rezeptoren binden und regulieren die Dynamik und die Organisation des Zytoskeletts Wachstum Kegel 3-6. Das Hauptziel dieser Navigations-Signale ist das Aktin-Filament-Geflecht, dass das Wachstum Kegel Peripherie und treibt Wachstum Kegel Motilität durch kontinuierliche Aktin-Polymerisation und dynamischen Umbau 7 füllt. Positive oder attraktive Führung Signale induzieren Wachstum Kegel drehen durch Stimulierung Aktin-Filament (F-Aktin) Polymerisation in der Region das Wachstum Kegel Peripherie, die näher an der Quelle der Lockstoff Cue. Das Aktin-Polymerisation Laufwerke lokales Wachstum Kegel Vorsprung, die Haftung der führenden Rand und axonale Elongation in Richtung der Lockstoff. Aktin-Filament-Polymerisation hängt von der Verfügbarkeit ausreichender Aktin-Monomer und auf Polymerisationskeime oder Aktin-Filament-Stacheldraht endet für die Zugabe von Monomer. Aktin Monomer ist reichlich vorhanden in chick Netzhaut-und Spinalganglien (DRG) Wachstum Kegel. Folglich steigt der Polymerisation schnell, wenn der freie F-Aktin Stacheldraht endet für Monomerzugabe werden. Dies geschieht in chick DRG und Retina Wachstum Kegel über die lokale Aktivierung der F-Aktin-Abtrennung Aktin Depolymerisation Faktor (ADF / Cofilin) ​​in das Wachstum Kegel Region näher an einem Lockstoff 8-10. Diese erhöhte ADF / Cofilin Aktivität trennt Aktinfilamente zu neuen F-Aktin Stacheldraht endet für die Polymerisation zu erzeugen. Die folgende Methode demonstriert diesen Mechanismus. Gesamtgehalt an F-Aktin ist durch Färbung mit Fluoreszenz-Phalloidin. F-Aktin Stacheldraht endet visualisiert werden durch den Einbau von Rhodamin-Aktin im Wachstum Kegel, die mit dem Verfahren in den folgenden, die aus früheren Studien anderer bewegliche Zellen 11, 12 angepasst ist beschrieben permeabilisiert werden. Wenn Rhodamin-Aktin bei einer Konzentration oberhalb der kritischen Konzentration für die Aktin-Monomer neben Stacheldraht endet hinzugefügt wird, baut Rhodamin-Aktin auf freie Stacheldraht endet. Wenn die attraktive Cue in einen Farbverlauf, wie wird aus einer Mikropipette positioniert, um eine Seite eines Wachstums Kegel freigegeben präsentiert wird, wird die Aufnahme von Rhodamin-Aktin auf F-Aktin Stacheldraht endet größer das Wachstum Kegel Seite in Richtung der Mikropipette 10 . Growth Zapfen sind klein und zart Zellstrukturen. Die Verfahren der Permeabilisierung, Rhodamin-Aktin Einbau, Fixierung und Fluoreszenz-Visualisierung sind alle sorgfältig gemacht und kann auf der Bühne einem inversen Mikroskop durchgeführt werden. Diese Methoden können auf das Studium vor Ort Aktin-Polymerisation in wandernde Neuronen, andere primäre Gewebe oder Zelllinien werden.

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Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von F-Aktin Stacheldraht endet in neuronale Wachstum Kegel beschrieben. Nach Kultivierung Neuronen auf Deckgläschen werden die Zellen mit einer Saponin-haltigen Lösung permeabilisiert. Dann enthält eine kurze Inkubation mit dem Saponin-Puffer mit Rhodamin-Aktin fluoreszierende Aktin auf freien Aktin Stacheldraht endet.

Labeling F-Aktin Barbed Endet mit Rhodamin-Aktin in permeabilisierten Neuronale Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

labeling-f-actin-barbed-ends-with-rhodamine-actin-permeabilized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Aufrufe.  University of Minnesota. Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von F-Aktin Stacheldraht endet in neuronale Wachstum Kegel beschrieben. Nach Kultivierung Neuronen auf Deckgläschen werden die Zellen mit einer Saponin-haltigen Lösung permeabilisiert. Dann enthält eine kurze Inkubation mit dem Saponin-Puffer mit Rhodamin-Aktin fluoreszierende Aktin auf freien Aktin Stacheldraht endet.

Serie: Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Recording Großflächige Neuronale Ensembles mit Silicon-Sonden in der narkotisierten Ratte

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...