Die Autoren danken Teele Palumaa für die Unterstützung bei den Zahlen. Aus dem National Health and Medical Research Council, Australien Gefördert durch Projektstipendium 1008046.

1. Dissoziierte Hippocampus Neuron Kultur <ol><li> Bereiten Deckgläser (Borosilikatglas): <ol><li> In 100%-igem Ethanol waschen. </li><li> Luft trocknen unter UV-Bestrahlung. </li><li> Mantel mit Poly-D-Lysin (0,5 mg / ml in 0,15 M Borat-Puffer, über Nacht bei 4 ° C). </li><li> Am nächsten Tag (Tag der Kultur) 3x waschen in PBS dann Mantel mit Laminin (2,5 ug / ml, Natur Maus Laminin) + 5% v / v hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS) in PBS für 2 Stunden bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Präparieren Sie embryonalen Tag 18 (E18) Rattenhippokampi und sammeln in PBS Calcium und Magnesium, auf Eis gekühlt enthält. Hinweis: Alle Versuchsprotokolle mit Tieren wurden von der Tierethikkommission der Universität von Melbourne genehmigt. </li><li> Vorbereitung der Papain und DNase I-Lösungen aus der Dissoziation Papain-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> In 50 ul DNase I-Lösung zu 1 ml Papain-Lösung. </li><li> HINWEIS: Sobaldzuerst hergestellt wird, kann das Papain-Lösung und die DNase I-Lösungen getrennt in Aliquots werden (0,5 ml und 25 &amp;mgr; l Aliquots für Papain und DNase I bezeichnet) und bei -20 ° C bis zum Gebrauch gelagert. </li></ol></li><li> Entfernen Sie so viel wie möglich PBS und Inkubation hippocampi (aus einem Wurf von Embryonen) mit 1 ml Papain / DNase I-Lösung bei 37 ° C für 15-20 min. Flick vorsichtig das Rohr, um die Inhalte während der Inkubationszeit zweimal mischen. </li><li> Man verreibt den Hippocampus-Gewebe sanft (die Vermeidung der Erzeugung von Bläschen) mit einer flammpolierten Pasteurpipette silikonisierten 10-15x, bis Zelldispersion erhalten wird, und wenige, wenn überhaupt, Gewebestücke von undissoziierten bleiben. </li><li> Sorgfältig Schicht dissoziierten Zellsuspension über eine 3 ml Kissen von 4% w / v Rinderserumalbumin (BSA) in Hanks ausgewogener Salzlösung plus Additive (HBSS +, siehe Abschnitt 1.6.1). <ol><li> Bereiten diese Stufengradienten Lösung durch Auflösen des BSA bei Raumtemperatur ohne RührenRing in HBSS mit 2 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO 3 und 40 mM Glucose (HBSS +) dann Sterilfilter und bei 4 ° C </li></ol></li><li> Zentrifuge, 100 g, 7 min in einer Tischzentrifuge mit Ausschwingrotor. </li><li> Entfernen der Überstand man aufpassen, nicht das Zellpellet abzusaugen. </li><li> Resuspendieren der pelletierten Zellen vorsichtig mit einem flamm poliert (silikonisiert) Pasteur-Pipette (oder eine 1 ml Pipettenspitze blau) in 1 ml komplette Neurobasalmedium (mit 2% B27, 0,5 mM L-Glutamin mit 1% FCS). </li><li> Graf zwei 10 ul Aliquots mit einer Zählkammer (NB zählen nur phasen hellen Zellen als &quot;Live&quot;-Zellen). </li><li> Platte primäre Neuronen auf vorbereitete beschichtete Deckgläschen (0,75 bis 1 x 10 5/18 mm Deckgläschen in 12-Well-Platte). Unmittelbar vor der Beschichtung, saugen überschüssiges Laminin / Serum-Lösung von Deckgläsern und ersetzen mit primären Neuronenkulturmedium (siehe unten). NB Die erforderliche nUmbra von Deckgläsern muss im Voraus bestimmt, wie Deckglas Zubereitung wird am Tag vor der Kultur begonnen werden (siehe Schritt 1.1). </li><li> Kultur primären Ratten-Hippocampusneuronen E18 bis zu 21 Tagen in vitro (DIV) in Neurobasalmedium, 2% B27, 0,5 mM L-Glutamin mit 1% FCS (hitzeinaktiviert) ergänzt. Führen Sie eine Halbmediumwechsel bei 7 DIV und danach wöchentlich. Die anti-mitotische Fluordeoxyuridin / Uridin wird auf 7 DIV hinzugefügt, 1/1, 000 Verdünnung von 10 mM von je Nukleosid) an Gliazellen übermäßiges Wachstum zu verhindern. </li></ol> 2. Antikörper Inkubation mit Live-Neuronen <ol><li> Während der ersten Woche in Kultur werden Neuronen entwickeln dendritischen Dornen und 2-3 Wochen, haben Neuronen ausreichend gereift unterziehen Synaptogenese 6,7. <ol><li> An ausgewählten Versuchszeitpunkt / s, wenden Sie den primären Antikörper in die Vertiefungen mit primären embryonalen Neuronen auf Deckgläsern verdreifachen. Hinzufügen eines Aliquots der Antikörper direkt in das Kulturmedium vondie primären Neuronen auf die gewünschte Endverdünnung Anmerkung: In diesem Beispiel wird ein polyklonaler Kaninchen-Antiserum gegen ein rekombinantes sezernierten Form des Proteins erhöht wurde 1/500 durch Zugabe von 2 &amp;mgr; l bis 1 ml Kulturmedium verdünnt, und, ein Zentrifugation für 10 min , 13.000 xg, RT kann vor der Einnahme einen aliquoten Teil des Antikörpers, wie dieses integriert sein wird er Partikel zu entfernen und kann dazu beitragen, Hintergrund. </li><li> Der Präimmunserum Kontrollen füge eine äquivalente Menge von Präimmunserum (in der gleichen Endverdünnung). Wenn kein Präimmunserum vorhanden ist, fügen Sie die gleichwertige Menge von Neurobasal Medium oder PBS (kein primärer Antikörper-Kontrolle). Alternativ, wenn eine geeignete primäre Antikörper ist, die intrazelluläre Region / Regionen des Proteins erkennt dieser Antikörper kann auch mit einer Steuer um Spezifität der Oberflächenfärbung testen zugesetzt werden. </li><li> Rückgabe der Zellen zu dem Kulturbrutschrank für 1-4 Stunden (dieser Inkubationszeit kann empirisch bestimmt werden). In unserem experiments wurde der Antikörper für den gesamten Zeitraum vorhanden, obwohl die Versuchsanordnung konnte eine Puls-Antikörper, gefolgt von einer weiteren Inkubation nach dem Auswaschen (a Pulse-Chase-Experiment) enthalten, um den Zeitverlauf der Internalisierung beurteilen. OPTIONAL: Diese Inkubation kann bei Raumtemperatur oder auf Eis durchgeführt werden, um die Rate der basalen Protein Internalisierung verlangsamen, falls erforderlich. Wenn in einem Nicht-CO 2-kontrollierten Umgebung durchgeführt wird, sollte das Medium, eine, die nicht gepuffert Bicarbonat vor der Zugabe der Antikörper / Antiserum geändert werden. ACHTUNG: Ältere Neuronenkulturen (&gt; 14 Tage und besonders kultivierten embryonalen Maus-Neuronen) keine Vollmediumwechsel gut vertragen. </li></ol></li><li> Wir haben Inkubationszeit für diesen primären Antikörper Internalisierung Schritt von 1 h, 2 h und 4 h mit guten Ergebnissen verwendet werden, obwohl die optimale Zeit auf Abundanz des Proteins von Interesse sowie die Dynamik abhängig von den Proteintransport in der CELls im Studium. HINWEIS: Die zweifarbige Bilder in Repräsentative Ergebnisse gezeigt, wurden mit einer Inkubation von 1 h bei 37 º C in einem Gewebekultur-Inkubator erhalten. </li><li> Nach Inkubation für den gewünschten Zeitraum, absaugen, die den Antikörper enthaltende Medium. Sanft aber schnell wieder waschen die Vertiefungen mit PBS bei Raumtemperatur. </li></ol> 3. Sekundäre Antikörper Anwendung auf Fest, permeabilisierten Zellen <ol><li> Fix Neuronen mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2, 5 min bei Raumtemperatur Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen Sie mit frisch zubereiteten Haarfestiger; alternativ Update, das bei -20 ° C gelagert wurde und aufgetaut vollständig, so dass keine ausgefallenen Para ist offensichtlich . ACHTUNG: Paraformaldehyd Fixiermittel sollten bereit und in einem Abzug gehandhabt werden. </li><li> Entfernen fix aus Brunnen (Übernahme in Abfallbehälter im Abzug) und spülen 3x mit PBS. <ol><li> OPTIONAL: Wenn gewünscht, auf Antikörper-Reagenzien zu sparen, können die Deckgläservorsichtig von der Platte mit 12 Vertiefungen mit einer Pinzette entfernt werden, und platziert Zell Seite nach oben, auf ein Blatt Parafilm auf der Basis eines Einweg-Kulturplatte gelegt. </li><li> Lösungen können dann leicht auf die Deckgläser pipettiert werden, so dass sie völlig ohne Lösungsüberflutung über den Rand des Deckglases auf den Parafilm abgedeckt sind. </li><li> Diese Technik eignet sich für Kurzzeit-Inkubation (1-2 Std.) jedoch mehr Inkubationen (zB über Nacht) sollte in einer feuchten Kammer durchgeführt werden. Alternativ können die Deckgläser wieder in die Vertiefungen der 12-Well-Platte für die Inkubation über Nacht und ausreichendes Volumen gegeben werden sollte hinzugefügt werden, dass die Deckgläser nicht austrocknen. </li></ol></li><li> Block für 30 min bei Raumtemperatur mit 5% BSA in PBS (Anmerkung: Sie Waschmittel in der Blockierungslösung in dieser Phase nicht hinzu, da es wichtig, dass die Zellen nicht permeabilisiert). </li><li> Um Oberflächenprotein, bevor Sie fortfahren mit UVEK beschriftention von internalisierten Protein, gelten die erste fluoreszenzmarkierten 2 ° Antikörper der Wahl. Anmerkung: In dem hier beschriebenen Beispiel wurde das primäre Antiserum in Kaninchen (in-house-Antikörper) einen rekombinanten sezernierten Isoform 4 angehoben. So kann der erste sekundäre Antikörper an die extrazelluläre Region des Trans Isoform auf der Oberfläche der permeabilisierten Neuronen nachzuweisen, haben wir Esel-Anti-Kaninchen-Dylight 649 (um 1/200 verdünnt in PBS mit 5% BSA). Es wird empfohlen, verdünnten sekundären Antikörperlösungen (10 min, 13.000 xg, RT) vor Gebrauch zentrifugiert. </li><li> Die Deckgläser Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Deck waschen (in Brunnen), 2x 5 min mit PBS. </li></ol> 4. Blockieren mit Excess unbeschriftet 2 ° Antikörper <ol><li> Blockieren die permeabilisierten Neuronen mit einer hohen Konzentration (&gt; 0,1 mg / ml) von unmarkiertem 2 ° Antikörper. <ol><li> Das unmarkierte 2 ° Antikörper sollte gegen die Spezies gezüchtet werden, in denenDer primäre Antikörper wurde durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur erhöht (in diesem Fall Kaninchen). </li><li> Für dieses Protokoll wurde AffiniPure F ab-Fragment Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (H + L) in einer Konzentration von 0,13 mg / ml verwendet. HINWEIS: Die Inkubation über Nacht wurde festgestellt, entscheidend, da eine kürzere Inkubation (2 h) zu sein war nicht ausreichend für eine vollständige Blockierung des primären Antikörpers, der nicht vollständig von dem markierten sekundären Antikörper gebunden wurde. </li></ol></li><li> Deck waschen (in Brunnen), 2x 5 min mit PBS. </li><li> Nach dieser Blockierungsschritt, nach Fixierung der Zellen mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2, 5 min bei Raumtemperatur. Spülen mit PBS (2x) nach der Entfernung der Fixierungsmittel (Fixiermittel Transfer zum Abfallbehälter im Abzug). </li></ol> 5. Permeabilisierung und Anwendung des Zweiten Fluoreszenz-konjugierte Antikörper 2 ° <ol><li> Permeabilisiert und blockieren die Zellen mit 5% BSA in PBS, enthaltend 0,1% Triton-X-100 bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Blocking-Lösung (darauf achten, dass die Deckgläser nicht austrocknen). In der zweiten fluoreszenz konjugierten 2 ° Antikörper mit einem anderen Fluorophor markiert. <ol><li> HINWEIS: Es muß möglich sein, diese Fluorophor-Markierung von dem vorher verwendeten unterscheidet, abhängig von den verfügbaren Anregungs / Emissionsfilter auf der konfokalen Mikroskop (siehe unten). </li><li> Für die in diesem Protokoll vorgestellten Beispiel wurde ein Alexa Fluor 488-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-2 °-Antikörper verwendet (um 1/200 in PBS, 5% BSA und 0,1% Triton-X-100). Inkubation 2 h bei Raumtemperatur entfernen Sie dann das 2 °-Antikörperlösung. </li></ol></li><li> Wash Deckgläser 3x 5 min mit PBS und schließlich kurz waschen mit entsalztem Wasser. </li></ol> 6. Montage-und Imaging <ol><li> Berg Deckgläser auf Glasobjektträger mit einem wässrigen Medium mit Montageantifade (zB Vectashield) und trocknen lassen. Shop im Dunkeln bei 4 ° C für optimal Erhaltung der Fluoreszenzsignalintensität. </li><li> Bildimmun Zellen auf einem konfokalen Mikroskop. <ol><li> Geeigneten Anregungs-und Emissionsfilter zur Detektion von zwei Fluorophor-Signale zur Verfügung stehen. </li><li> Wenn verschiedene experimentelle Bedingungen (zB Internalisierung Raten unter depolarisierten 8,9 oder Kontrollbedingungen) verglichen werden, sicherzustellen, dass alle replizieren Deckgläser aus den verschiedenen Bedingungen sind mit den gleichen Bildaufnahmeparameter abgebildet. Die integrierte Dichte der Standardregionen von Interesse oder der puncta Attribute (zB Anzahl, Größe) aus den resultierenden Bilder können dann mit Standard-Bildanalyse-Software (z. B. Fiji / ImageJ, Metamorph) gemessen werden. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier beschriebene Technik ist komplementär zu der Biotinylierung der Zelloberfläche (durch Arancibia-Carcamo et al. Bewertung) 12 und es ist die Methode der Wahl für die Bewahrung von Informationen über die subzelluläre Lokalisation des internalisierten Protein, sofern eine geeignete primäre Antikörper an ein extrazelluläres Epitop ist. Darüber hinaus kann die Quantifizierung von Proteintransport / Internalisierung über die Zeit (durch Fixieren Deck zu verschiedenen Zeiten während der ...

Bei der Festlegung der Funktion der neu identifizierten Proteine, Untersuchung der subzellulären Lokalisation und Menschenhandel des Proteins in Frage wichtige Hinweise auf die wahrscheinliche Rolle / s des Proteins 1,2 bieten. Bioinformatische Analyse des Transkriptoms der Entwicklungs Neocortex 3 hat uns mit einer Liste von Genen veränderte Expression während der Maushirn Kortikogenese zeigt. Dann nahm eine Gen-Knockout-Ansatz, um festzustellen, dass das Protein durch eines dieser Gene, sez6 codiert, hat eine Schlüsselrolle in der Neuronenentwicklung. Wir beobachteten, dass die Beschlagnahme-verwandtes Gen 6 oder Sez6, Protein ist in der Entwicklung Dendriten und ist auch in dendritischen Dornen, spezialisierte Strukturen auf Dendriten, die Aufnahme und Integration von erregenden Signale vorhanden. Darüber hinaus, wenn dieses Protein fehlt, Dendriten und Synapsen nicht einwand 4 zu bilden. Die wahrscheinliche dominante Isoform des Proteins hat die Eigenschaften eines TransmembranE-Rezeptor, obwohl, wenn die subzelluläre Verteilung von immunmarkierten Proteins wurde durch konfokale Mikroskopie oder Immun-Elektronenmikroskopie untersucht die meisten, wenn nicht alle, der das Signal erschien mit kleinen Bläschen in der somatodendritischen Fach mit wenig oder kein Protein auf der Plasmamembran markiert zugehörigen an der Zelloberfläche. Um endgültig zu zeigen, dass diese mutmaßlichen Rezeptor mit einem vorhergesagten großen extrazellulären Domäne in der Plasmamembran gehandelt hat man eine Lebendzell-Ansatzes unter Verwendung des Antiserums wir an einen extrazellulären Teil des Proteins erzeugt hatte, um Protein auf der Zelloberfläche zu markieren. Durch die Kombination dieser &quot;Antikörper Fütterung&quot; Ansatz mit zwei Anwendungen der differentiell markierten sekundären Antikörper, der durch eine umfassende Sperrschritt und einem Schritt Permeabilisierung getrennt waren wir in der Lage, zwei verschiedene Pools von Protein unterschieden durch Bindung an fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper tragen verschiedene fluoreszier identifizierenent-Tags. So konnten wir Protein, das während der Antikörper-Inkubation Schritt von Protein, das entweder blieb auf der Zelloberfläche oder wurde während dieser Zeit auf die Oberfläche Handel durch Endozytose internalisiert worden war, zu unterscheiden. Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir, dass das Protein von Interesse wird zu und von der Zelloberfläche in Neuronen gehandelt. Daher hat sich diese relativ schnell und einfache Technik informativer als traditionelle Methoden Immunzytochemie oder vorge Einbettung Immunelektronenmikroskopie, trotz der Tatsache, dass wir verwendeten die gleiche polyklonalen Kaninchen-Antiserum für alle diese Techniken. Diese Technik ist allgemein anwendbar auf irgendeine Transmembranprotein ein gutes Antikörper Epitope erkennen, die extrazelluläre Domäne ist. Die Technik bereits verwendet wurde, um die Rezeptorhandel der Glutamat-Rezeptor-Untereinheit GluR1 5 zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

Um die Zelloberflächen-Lokalisierung eines mutmaßlichen Transmembran-Rezeptor in kultivierten Neuronen demonstrieren, das Protein markiert man auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen primären Antikörper gegen einen extrazellulären Teil des Proteins erhöht. Da die Rezeptoren an und von der Oberfläche gehandelt, wenn Zellen werden permeabilisiert, dann nach der Fixierung sowohl der Zelloberfläche und interne Protein um denselben markierten sekundären Antikörper nachgewiesen werden. Hier passten wir eine Methode verwendet, um Proteintransport (&quot;Antikörper Zeit&quot;) zu studieren, um Label-Protein, das während der Antikörper-Inkubation Schritt und Protein, die entweder blieb auf der Zelloberfläche oder wurde in dieser Zeit an die Oberfläche Handel durch Endozytose internalisiert worden war differentiell . Die Fähigkeit, diese beiden Pools von Protein unterscheiden durch den Einbau einer Übernachtblockierungsschritt mit hochkonzentrierten unmarkierten sekundären Antikörpers nach einer anfänglichen incubatio möglich wurden der permeabilisierten Neuronen mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper. Nach dem Blockierungsschritt, Permeabilisierung der Neuronen erlaubt Detektion des internalisierten Pool mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörpers mit einem anderen Fluorophor markiert. Mit dieser Technik konnten wir wichtige Informationen über die subzelluläre Lage dieses mutmaßlichen Rezeptor zu erhalten, offenbart, dass es in der Tat auf der Zelloberfläche in Neuronen gehandelt. Diese Technik ist allgemein anwendbar auf einen Bereich von Zelltypen und Zelloberflächen-Proteine, die eine geeignete Antikörpers an ein extrazelluläres Epitop ist.

Die Zweifarben-Fluoreszenz Immunfärbetechnik präsentierten nützlich zur Markierung von extrazellulären Domänen von Transmembran-Proteinen in lebenden Zellen (in 1 schematisch gezeigt). Während der Inkubationszeit, die Immunglobuline binden zugängliche Epitope und ein Anteil der Bevölkerung von Proteinmolekülen zusammen mit gebundenem Antikörper wird durch Endozytose aufgenommen. Zusätzlich kann neu synthetisierten Proteins an die Zelloberfläche über Terminhandel zu erreichen und recycelt Pr...

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Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Aufrufe.  The University of Melbourne.  Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt. 

Serie: Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Forschung

Neurowissenschaften

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen