Die Studie wird unterstützt von US Public Health Service Grant DK-081527, DK-072473 und DK-20595 an die University of Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal Models Core), und ein Geschenk der Kovler Family Foundation.

1. Erstellen von virtuellen Scheiben Immunhistochemisch Stained Images <ol><li> Öffnen StereoInvestigator. Legen Sie die sauberen Objektträger hält die Probe in das Mikroskop Halter und visualisieren sie in Stereo Investigator, indem Sie auf &quot;Erwerb&quot; und dann &quot;Live-Bild&quot; (Acquisition → Live-Bild). Bestimmen Exposition für jeden Kanal, in unserem konkreten Beispiel, Kanal 2 für die DAPI, Kanal 3 für GFP, Channel 4 für RFP, Channel 5 für Cy5 und Channel 6 für Cy7 verwendet. Verwenden Sie die &quot;Video Histogram&quot;-Fenster, das die Intensität der Fluoreszenz-Displays, um die Belichtung zu bestimmen. Entsprechende Fluoreszenzintensitäten sind erreicht, wenn die Intensität Schwänze ab am rechten Ende des Video Histogramm. Die Grenzwerte können in der &quot;Camera Settings&quot;-Fenster geändert werden. Das Video Histogramm kann mit dem Mikroskop Fokussierrad fokussiert werden. </li><li> Vor der Erstellung eines virtuellen Slice, Kontur der Probe durch einen Klick auf dem Bildschirm an einem Punkt von der Probe entfernt, die einen Verweis Punkte-Marke wird, und klicken Sie dann auf um die Kontur der Probe. Wenn die Kontur vollständig ist, rechte Maustaste und wählen Sie &quot;Close Contour&quot;, um die Anfangs-und Endpunkte zu verbinden. </li><li> Sobald die Kontur geschlossen ist, erfasst eine virtuelle Scheibe für die Probe (Acquisition → Acquire Virtuelle Slice). Wenn die virtuelle Scheibe Fenster Optionen zu öffnen, wählen Sie &quot;High Speed ​​Acquire&quot; sowie die automatische Fokussierung, indem Sie das Kontrollkästchen neben &quot;Manuell&quot;. Speichern Sie die Datei. </li><li> Die virtuelle Scheibe Vorfokussierung muss durch die Auswahl kalibriert werden (rechte Maustaste → Zu Site List Focus) und manuell Fokussierung mehrere zufällige Abschnitte, dh Websites, in der virtuellen Scheibe Vorschau. Wenn mehrere Standorte wurden konzentriert, starten Sie die virtuelle Scheibe (rechte Maustaste → Start Virtual Slice mit Vorfokussierung). Nach der virtuellen Scheiben für die erste Probe abgeschlossen ist, zum nächsten Kanal zu wechseln und die Belichtung entsprechend an. Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 für jeden Kanal. </li></ol> 2. Computer-assisted Two-Dimensional Analysis Die Quantifizierung der Islets <ol><li> Die Bilder werden dann verarbeitet mit einem ImageJ Makro namens &quot;IHCVS&quot;, die zuerst bereitet geladenen Bilder zur Analyse und Quantifizierung Merkmale von Inseln wie zelluläre Zusammensetzung (dh jeder Bereich der beta-, alpha-und delta-Zell-Populationen und Inselchen Gebiet an der Summenwert). Der Stapel wird in die einzelnen Kanäle in ImageJ aufgeteilt, wobei jedes einzelnen Kanals ein eigenes Bild über die immunhistochemische Färbung Basis zeigt. Jedes Bild wird dann automatisch Schwellenwert, nach dem ein 8-Bit-Schwarz-Weiß-Bild oder eine Maske, der Schwellenwert Bild erzeugt wird. Die separaten Kanal Bilder werden dann zusammen rechnerisch in einem zusammengesetzten Maske hinzugefügt und ImageJ der eingebauten Partikel-Analyse basiert auf der Composite-Bild durchgeführt. </li><li> ROIs werden dann identifiziert, während ohne Partikel, die kleiner als eine einzige Beta-Zellen (&lt;170 um 2; Fläche berechnet einen Durchmesser von ~ 15 &amp;mgr; m; Hara et al, 2003.). Der resultierende ROIs werden analysiert und quantifiziert ImageJ; Quantifizierung Perimeter (Abstand umgibt eine Fläche), Zirkularität (ein gewisses Maß an Rundheit, wo die Zahl 1,0 zeigt einen perfekten Kreis), Feret der Durchmesser (die längste Strecke in einem Raum) und in der Mitte sind Koordinaten für jeden analysierten Region, so dass die Insel Verteilung mathematisch analysiert werden kann unter Verwendung verschiedener Kombinationen dieser Parameter und aufgezeichnet in einer 3D-Grafik, deren Daten werden für die mathematische Modellierung verwendet werden. Eine einzelne virtuelle Scheibe Bild ist in 30 Sekunden analysiert. Mehrere Bilder können durch die Einbettung der Bildverarbeitung und-analyse Skript in einer Schleife Syntax von ImageJ Makrosprache unterstützt analysiert werden. Die Schleife öffnet alle Dateien in einem bestimmten Verzeichnis, analysiert die Bilder und gibt Ergebnisse in einen neuen Standort als Excel-Datei. </li><li> Die aggregierten Ergebnisse werden in eine Excel-Tabelle gespeichert, die Speicherung von Daten wie Fläche, Umfang, Rundheit, Feret der Durchmesser und Inselchen Zentrum für jede Insel, zusammen mit den entsprechenden Zahlen in der Abbildung dargestellt. </li></ol> Computergestützte Analyse und Histogramm-Setup <ol><li> Mathematica-Skripte, die automatisch einmal gestartet ausführen, werden verwendet, um die Spreadsheet-Daten gesammelt Prozess, in Höhe von Hunderttausenden von Einträgen. Einer der kritischen Prozesse, die ausgeführt werden ist eine Frequenz-Analyse, die ein Histogramm zur Größenverteilung zu untersuchen und auch Ausreißer in den Daten zu bestimmen Konstrukte. Unter dem Skript ist insgesamt Inselchen Bereich gemessen und mit anderen Parametern, insbesondere zu Zeitpunkten oder das Alter der Bauchspeicheldrüse, und dann entsprechend in einem Diagramm angezeigt. </li></ol> 3. Dreidimensionale Rekonstruktion von zweidimensionalen Immunhistochemisch Stained virtuellen Schnittbilder 3D-Rekonstruktion von Virtual Slices <ol><li> Kopieren Sie das Skript (&quot;im_jp2_2_tiff&quot;) in das Verzeichnis (also Ordner)enthält die jp2 Bilder. Führen Sie das Skript mit der Linux-Shell durch Eingabe von &quot;./im_jp2_2_tiff&quot; in die Konsole und dann Enter drücken. Wenn Sie dieses Skript für Sie automatisch alle der jp2 Bilder in dem Verzeichnis, in TIFF-Dateien, die das Format in den Bau und die Quantifizierung von dreidimensionalen Stapel aus dem virtuellen Scheiben verwendet wird. (Hinweis:. Geben Sie &quot;chmod + x im_jp2_2_tiff&quot;, wenn das Skript nicht ausgeführt, die den Text-Datei in ein Script umwandeln, so dass es richtig laufen kann) </li><li> Wenn alle erfassten Bilder jp2 TIFF-Dateien umgewandelt wurden, sind sie bereit, für die Analyse in ImageJ verwendet werden. </li><li> Mit ImageJ, öffnen Sie alle Bilder für die erste Probe (fünf Bilder in diesem Fall: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) auf und verschmelzen sie zu einem Bild (Bild → Farbe → Kanäle zusammenfügen). Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede der Proben. Wenn alle Proben als einzelne Bilder wurden zusammengefasst, reinigen Sie die Bilder durch unerwünschte Bereiche mit dem &quot;Polygon-Selektionen&quot; Werkzeug und füllt sie in (Edit → Fill). (Die Größe der Bilder auf eine kleinere Größe, wenn nötig). Dann konvertieren jedes Bild in ein RGB-Bild (Bild → Typ → RGB-Farbe). Schließlich erstellen Sie einen Stapel aus den Bildern (Bild → Stacks → Bild zu Stacks), nach der sie weiter mit dem &quot;Stack Reg&quot; plugin ausgerichtet werden, falls erforderlich. Letztlich Zusammenlegung der Kanäle und dann die Kombination der Bilder erstellt ein 3D-montage aller Inseln in der gesamten Bauchspeicheldrüse. Um das Bild auf &quot;Plugins&quot; klicken und dann &quot;3D-Viewer.&quot; </li></ol> 4. Islet Mapping Sammeln Bildstapel <ol><li> Situate der ganze Berg Pankreasinseln unter dem Mikroskop. </li><li> Öffnen Sie die Slidebook Software. Besuchen Sie das &quot;Capture und Focus Control&quot; durch Drücken von &quot;Strg + Umschalt + E.&quot; In der &quot;Focus Control&quot;-Fenster, das Ziel festgelegt, bis 20X oder 40X, abhängig von der Größe der Insel. Bewerben Wasser, wenn mit einem Eintauchen in Wasser Objektiv. </li><li> Um die Mikroskop-Okular zu verwenden, um Inseln zu finden, stellen Sie &quot;Bin&quot; zu 2X und setzen Sie die Filter-Set für User1 in der &quot;Focus Controls&quot; Fenster. &quot;Emission Selection&quot; sollte zu 100% Eyes and Neutral Density auf 1 gesetzt werden. Klicken Sie auf &quot;GFP ey&quot; und dann &quot;Open Fluor.&quot; </li><li> Zur Visualisierung der Probe in Slidebook, um den Fokus wieder Controls Fenster und schalten Sie &quot;Filter Set&quot; auf &quot;Live&quot; und klicken Sie auf &quot;GFP ds.&quot; Verwenden Sie den Joystick zum Zentrum der Insel in die Kamera 1 Fenster so gut wie möglich. Fokus auf eine Tiefe irgendwo in der Nähe der Mitte der Insel, wo die Zellen leicht zu erkennen. </li><li> In der &quot;Focus-Steuerelemente&quot;, wählen Sie die &quot;Z Register.&quot; Klicken Sie setzen in der oberen linken Ecke des Fensters, um die aktuelle Tiefe als Referenzpunkt gesetzt. Verwenden Sie den Umfang die Steuerung an den obersten Tiefe der Insel in die Funktionen klar erkennbar sein scrollen und auf &quot;Set-Top.&quot; Blättern Sie zum Ende der Insel und klicken Sie auf &quot;Set Bottom.&quot; Klicken Sie auf &quot;Go&quot;, um den Bezugspunkt zurück. </li><li> Im Capture-Fenster, &quot;Bin Factor&quot; auf &quot;2X&quot; und stellen Sie &quot;Filter Set&quot; auf &quot;Live&quot;. Stellen Sie den &quot;Capture&quot; auf &quot;3D&quot; (und nur 3D). Auf der rechten Seite des Fensters, klicken Sie auf &quot;Use Top und Bottom Position.&quot; Klicken Sie auf &quot;Return to Point nach Aufnahme Reference.&quot; Stellen Sie die &quot;Step Size&quot; auf &quot;3&quot;. </li><li> Unter den &quot;Filter Set Box&quot;, wählen Sie DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU und Cy5 DSU. Für jeden, klicken Sie auf &quot;Best Find&quot; unter &quot;Belichtung anpassen&quot;, klicken Sie dann auf &quot;Test&quot;, um sicherzustellen, dass die gewählte Exposition geeignet ist. Klicken Sie auf &quot;Start&quot;, um die Aufnahme zu beginnen. </li><li> Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, stellen Sie die Pegel wie nötig und ändern Sie die angezeigte Farbe für RFP auf Weiß. Speichern Sie die Folie und gehen Sie zu → Export → TIFF-Serie ansehen. Geben Sie den Namen des Schlittens mit einem Schuss am Ende und zu speichern. Dutzende von einzelnen TIFF-Dateien erstellt werden, so kann es hilfreich sein, um jede Insel das Image Stack in einem separaten Ordner zu halten. </li></ol> Mapping Bildstapel <ol><li> Öffnen Stereo Investigator. Visualisieren Sie das Bild durch das Öffnen der Bildstapel (File → Image Stack → Image Stack Open). In der &quot;Image Scaling Menü&quot; set &quot;Abstand zwischen den Bildern&quot; zu 3,00 um. Zur Korrektur der 2X Binning in Slidebook, wählen Sie &quot;Override X-und Y-Skalierung&quot; und &quot;User für Quelle von X und Y angegeben&quot; Skalierung, und geben Sie 0,65 für X und Y. </li><li> Zentrieren Sie das Bild, indem Sie in der Mitte der Insel von Interesse in der &quot;Makro-Fenster.&quot; Mark mindestens eine Zelle mit den entsprechenden Marker. Beta-Zellen erscheinen grün, wird alpha-Zellen erscheinen rot, und delta-Zellen weiß erscheint, benutzen Sie Marker 2 (ein hohler Kreis), um Beta-Zellen, Marker 5 (ein hohles Dreieck) markieren, um den Alpha-Zellen markieren und Markierung 6 ( ein hohles Dreieck), um delta-Zellen. Die Zellen sollten in den Mittelpunkt ihres Kerns, die blau erscheinen wird, wenn die Probe wurde mit DAPI gefärbt markiert werden. </li><li> Sobald mindestens eine Zelle markiert wurde, zeigen die &quot;Orthogonal View&quot; über das Symbol in der oberen Menüleiste. Check &quot;Z-Filter&quot; und &quot;Symmetric.&quot; Das Spektrum should bis 15,00 eingestellt werden. Ab das 0,0-Z-Ebene, durch die Insel mit dem Mausrad scrollen und markieren Sie die Zelle mit der entsprechenden Markierung. Jede Zelle darf nur einmal in den Mittelpunkt seiner Tiefe gekennzeichnet werden. Nach Beendigung Kennzeichnung jedes der Z-Ebenen, die &quot;Z-Filter aktivieren&quot; kann deaktiviert werden. Dadurch werden alle von den Markern von allen Z-Ebenen. </li><li> Wenn jede Zelle markiert wurde, speichern Sie die Datei als &quot;DAT&quot;-Datei, dann gehen Sie zu → Export Tracing-Datei. Speichern Sie die Verfolgung als &quot;TXT&quot;-Datei. Klicken Sie auf &quot;New Data File&quot;, um den Arbeitsbereich, bevor Sie neue Inseln Karte klar. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Die Erstellung des virtuellen Slices aus einer immunhistochemisch gefärbten Bauchspeicheldrüse Probe ermöglicht es, alle von den endokrinen Zellen zu untersuchen (alpha, beta und delta-Zellen) in der gesamten Bauchspeicheldrüse, die beide zusammen als Inseln (Abbildung 1A) und einzeln in getrennten Kanälen ( Abbildung 1B). Mit Hilfe von Computer-Programmen und Skripten, kann eine Masse Analyse der umfangreichen Daten über diese virtuelle Schnitte durchgeführt werden. Insbesondere wird eine Partikelanalyse von Composite-Masken (Abbildung 1C) Ausgabe als Statistik-Tabelle mit Parametern wie Inselchen Fläche, Umfang (der Abstand umgibt eine Fläche), Zirkularität (ein gewisses Maß an Rundheit, wo 1,0 stellt einen perfekten Kreis) und Feret der Durchmesser (die längste Strecke in einem Raum) für jede Insel entdeckt (Abb. 1D). Die groß angelegte Analyse dieser Bilder ergibt in der Produktion von insgesamt Inselchen Anzahl und Größe Verteilungshistogramme sowie einen detaillierten Vergleich der alpha-, beta-und delta-Zell-Bereiche. Darüber hinaus ist jede virtuelle Scheibe in einer Tiefe von etwa 5 um genommen, und alle einzelnen 2D virtuelle Schnitte sind weitere gestapelt werden, um eine 3D-Rekonstruktion des gesamten Pankreas Probe zu schaffen. Islet Mapping zeigt ein weiteres Beispiel nicht nur für den Fang von kleinen Inseln in 3D, sondern auch detaillierte computergestützte Analyse. Islet Mapping besteht aus der Erfassung der verschiedenen Inseln (Abbildung 2A) und die anschließende Markierung von alpha-, beta-und delta-Zellen an verschiedenen Z-Ebenen (Abbildung 2B) auf einer kleinen Insel in 3D (Abbildung 2C, D) zu visualisieren. Automatisierte mathematische Analyse abgebildet Inselchen zeigt deren zelluläre Zusammensetzung und Architektur, einschließlich Zell-Zell-Distanzen (Abbildung 2E) und kumulativen Wahrscheinlichkeiten von Zell-Zell-Distanz-Distributionen (Abb. 2F). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Großflächige Erfassung und Analyse von Insel-Verteilung mit Virtual Slice. A. Virtuelle Scheibe Ansicht eines menschlichen Pankreas-Abschnitt. a. Immunhistochemische Färbung für Insulin (grün), Glukagon (rot), Somatostatin (weiß) und DAPI (blau). b. Umgerechnet 8-Bit-Maske nach der automatischen Schwellenwert. Ein boxed-Bereich ist in BB Ansichten der einzelnen Kanäle vergrößert. a. delta-Zellen, b. beta-Zellen, c. alpha-Zellen, und d. verschmolzen zusammengesetztes Bild. C. Partikelanalyse auf Composite-Maske durchgeführt. Beachten Sie, dass jedes Inselchen Struktur einschließlich der kleinen Zellhaufen ist nummeriert (blau markiert). D. Statistik Tabelle der verschiedenen Parameter für die einzelnen Strukturen gemessen, die IDs, die tags in C dargestellt entsprechen müssen <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 2. Analyse immunhistochemische Virtuelle Slice. A. 3D-Punktwolke der Abbildung 1 zeigt Größe und Form Verteilung jedes Inselchen durch Parameter wie Fläche, Rundheit und Feret der Durchmesser. B. 3D-Punktwolke der Abbildung 1 zeigt zellulären Insel Zusammensetzung und Größe. C. Islet Größenverteilung der ganzen menschlichen Bereich Analyse aus Abbildung 1 zu einer logarithmischen Wahrscheinlichkeitsverteilungsdichte ausgestattet. D. Mathematische Analyse von zellulären Zusammensetzung Verhältnisse (beta-Zellen in grün, alpha-Zellen in rot und delta-Zellen in blau) für jedes Inselchen Wirkdurchmesser bin der Abbildung 1. E. a. Islet Größenverteilung von Stichproben immunhistochemische Analyse (links). Islet Größenverteilung der virtuellen Scheibe Analyse (rechts). b. Log-Normal Plot Vergleich der Stichproben immunhistochemische Analyse (rot) und virtuellen Bereich (blau). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Islet Mapping und mathematische Analyse der zellulären Zusammensetzung und Architektur. A: Screen-Capture-Darstellung einer gemeinsamen Brennebene von einer 3D-Rekonstruktion von Stapel von Bildern des menschlichen Inselzellen in Stereo-Investigator hochgeladen (beta-Zellen in grün, alpha-Zellen in rot, delta-Zellen in weiß und Kerne in blau) . B: Fluoreszenz-Bilder (links) und entsprechende zugeordnete Daten (rechts) in drei verschiedenen Fokusebenen in einem Abstand von 10 pm gezeigt. C: Repräsentative Blick auf 3D-Rekonstruktion von Insel-Mapping-Daten. D: 3D-Rekonstruktion des Quartals-aufgeschnitten Insel auf die Koordinaten von Inselzellen Mapping erzielt wurden. E: Mathematische Analyse von zellulären Zusammensetzung und Architektur. Left. Relative Häufigkeit der Zell-Zell-Abstände zwischen zwei Zellen in einer einzelnen Zelle Bevölkerung. Right. Relative Häufigkeit der Zell-Zell-Abstände zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) zu testen. Left. Kumulative Wahrscheinlichkeiten von Zell-Zell-Distanz-Distributionen für Alpha-to-alpha, beta-to-beta und delta-to-delta-Zellen. Right. KS-Abstände für die entsprechenden drei kumulativen Wahrscheinlichkeiten.

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	<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l., Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture+-+a+comparative+study.">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li></ol>

Der Computer-assisted großflächige Visualisierung und Quantifizierung hier vorgestellten leisten vier zentrale Punkte in Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Studien: (1) Eine groß angelegte Analyse der Bauchspeicheldrüse Proben bietet einen umfassenden Überblick der gesamten Insel Größenverteilung und Inselchen Architektur. (2) Die 3D-Rekonstruktion und mathematische Analyse der zellulären Zusammensetzung und Architektur weiteren Erleichterung der Prüfung der räumlichen Anordnung der endokrinen Zellen innerhal...

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
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<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus </td>
<td>IX-81
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture

Die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse ist eine einzigartige Mikro-Orgel von mehreren Hormon sezernierenden endokrinen Zellen wie Beta-Zellen (Insulin), alpha-Zellen (Glukagon) und delta-Zellen (Somatostatin), die in der exokrinen Gewebe eingebettet sind, und bestehen aus 1 zusammengesetzt - 2% der gesamten Bauchspeicheldrüse. Es besteht eine enge Korrelation zwischen Körper und Bauchspeicheldrüse Gewicht. Insgesamt Beta-Zellmasse nimmt ebenfalls proportional zu der Nachfrage nach Insulin im Körper auszugleichen. Was entgeht dieser verhältnismäßig Expansion ist die Größenverteilung der Inseln. Große Tiere wie Menschen haben ähnliche Insel Größenverteilungen mit Mäusen, was darauf hindeutet, dass diese Mikro-Orgel eine bestimmte Größe begrenzt funktionsfähig sein muss. Die Unfähigkeit der großen Tier Pankreata proportional größeren Inseln zu erzeugen, ist durch einen Anstieg in der Anzahl der Inseln und durch eine Erhöhung des Anteils der größeren Inseln in ihrer gesamten Insel Größenverteilung kompensiert. Darüber hinaus weisen Inselchen eine auffallende Plastizität in zelluläre Zusammensetzung und Architektur zwischen den verschiedenen Arten und auch innerhalb der gleichen Art unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir neue Ansätze für die Analyse biologischer Bilddaten, um die Automatisierung von analytischen Verfahren, die für die Analyse von großen und heterogenen Datensammlungen in der Studie von solchen dynamischen biologischen Prozessen und komplexen Strukturen erlauben zu erleichtern. Solche Studien haben aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Probenahme unvoreingenommene behindert worden und die Generierung großer Datenmengen genau zu erfassen die Komplexität der biologischen Prozesse der Insel Biologie. Hier zeigen wir Methoden, um unvoreingenommene &quot;repräsentative&quot; Daten innerhalb der begrenzten Verfügbarkeit von Proben (oder an die Probennahme zu minimieren) und die Standard-experimentellen Einstellungen zu sammeln und genau analysieren die komplexen dreidimensionalen Struktur der Insel. Computer-gestützte Automatisierung ermöglicht die Sammlung und Analyse von großen Datenmengen und sorgt auch unvoreingenommene Interpretation der Daten. Darüber hinaus die präzise Quantifizierung der Insel Größenverteilung und räumlichen Koordinaten (dh X, Y, Z-Positionen) führt nicht nur zu einer genauen Darstellung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Struktur und Zusammensetzung, sondern auch ermöglicht es uns, Muster während der Entwicklung und Anpassung an die Veränderung Bedingungen zu identifizieren durch mathematische Modellierung. Die Methoden in dieser Studie entwickelten gelten für Studien von vielen anderen Systemen und Organismen sowie.

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Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Neuartige computergestützte Methoden der großflächigen Beschaffung und Analyse der immunhistochemisch gefärbten Pankreas Proben werden beschrieben: (1) Virtuelle Scheiben Erfassung der gesamten Abschnitt, (2) Messe Analyse der umfangreichen Daten, (3) Rekonstruktion von 2D-Virtuelle Schnitte , (4) 3D-Mapping-Insel, und (5) Mathematische Analyse.

Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

computer-assisted-large-scale-visualization-quantification-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  University of Chicago. Neuartige computergestützte Methoden der großflächigen Beschaffung und Analyse der immunhistochemisch gefärbten Pankreas Proben werden beschrieben: (1) Virtuelle Scheiben Erfassung der gesamten Abschnitt, (2) Messe Analyse der umfangreichen Daten, (3) Rekonstruktion von 2D-Virtuelle Schnitte , (4) 3D-Mapping-Insel, und (5) Mathematische Analyse.

Serie: Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Forschung

Biologie

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

In situ Quantifizierung von Pankreas-Beta-Zellmasse in Mäuse

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...