Dieses Protokoll beschreibt eine stabilisierte und sich wiederholende zelluläre In-vivo-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit einem neuartigen intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, bewegungslose, dreidimensionale Bildgebung mit Auflösung bis zur zellulären Ebene über drei Wochen in der Bauchspeicheldrüse einer lebenden Maus durchzuführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der chirurgischen Plattform und desinfizieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.
Verwenden Sie nach der Betäubung eine rektale Sonde mit einem homöothermisch gesteuerten Heizkissen, um die Körpertemperatur zu überwachen. Entfernen Sie haare von der linken Flanke der Maus und tragen Sie alternativ Alkohol und Jod auf, rotieren Sie von der Inzisionsstelle zur äußeren Oberfläche, gehen Sie nie zurück zur Inzisionsstelle und enden Sie mit Jod. Machen Sie dann einen 1,5 Zentimeter genauen Schnitt an der linken Flanke der Maus und sezieren Sie die Haut und den Muskel.
Verwenden Sie eine schwarze oder Nylon-4-0-Naht, um eine Geldbörsensaite am Schnittrand durchzuführen. Ziehen Sie die Milz vorsichtig mit einer Ringzette und identifizieren Sie die Bauchspeicheldrüse. Platzieren Sie das Fenster an der Flanke der Maus, führen Sie die Milz und die Bauchspeicheldrüse durch den offenen Raum des Fensters.
Legen Sie dann die Bauchspeicheldrüse vorsichtig auf die Platte des Bildfensters, während Sie die Milz auf den offenen Raum des Fensters legen. PanC-1 nuclite red direkt in die Bauchspeicheldrüse injizieren. Verwenden Sie eine 31-Gauge-Katheternadel, um Tropfen n-Butyl-Cyanacrylat-Klebstoff auf den Rand des Bildgebungsfensters aufzutragen, um sicherzustellen, dass nur eine minimale Menge Klebstoff aufgetragen wird.
Tragen Sie vorsichtig ein 12 Millimeter rundes Deckglas auf den Rand des Abbildungsfensters auf. Halten Sie dann die Nahtschlaufe, um in die seitliche Nut des Fensters zu passen, und binden Sie sie dreimal. Um die Unterbrechung dieser engen Stiche zu verhindern, wenn die Mäuse wach sind, schneiden Sie die maximale proximale Stelle der Krawatte ab.
Beginnen Sie mit dem Einschalten des Intravitalenmikroskops einschließlich der Laserleistung. Um einen Gefäßkatheter einzuführen, drücken Sie mit dem Zeige- und dritten Finger auf die proximale Seite des Schwanzes. Bei Bedarf den Schwanz mit einer Lampe erhitzen.
Desinfizieren Sie die Schwanzvene mit einem 70% Ethanolspray, führen Sie dann einen 30-Gauge-Katheter in die laterale Schwanzvene ein und visualisieren Sie das Aufstoßen von Blut im PE-10-Röhrchen. Tragen Sie Seidenband auf den Katheter auf, um ihn zu stabilisieren. Injizieren Sie FITC-Dextran und TMR-Dextran oder gegebenenfalls andere fluoreszierende Sonden entsprechend der Kombination von Fluoreszenzsonden.
Setzen Sie eine Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur automatisch mit einem homöothermischen Heizkissensystem zu steuern. Setzen Sie dann das pankreatische Bildgebungsfenster ein, das während der intravitalen Mikroskopie vorbereitet wurde, in den Fensterhalter. Übertragen Sie die Maus von der operationsigen Plattform in die bildgebungsgebende Phase.
Um eine intravitalen Bildgebung durchzuführen, beginnen Sie mit der Bildgebung der Bauchspeicheldrüse bei einer geringen Vergrößerung, z. B. viermal, um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreasbildfenster zu scannen. Sobald der interessierende Bereich bestimmt wurde, wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung, z. B. 20- oder 40-fach, um Eine Bildgebung auf zellulärer Ebene mit einer lateralen und axialen Auflösung von etwa 0,5 Mikrometern bzw. 3 Mikrometern durchzuführen. Führen Sie Z-Stack- oder Zeitrafferbilder durch, um die 3D-Struktur oder Dynamiken auf zellulärer Ebene wie Zellmigration zu beobachten.
Die Intravitalenmikroskopie in Kombination mit dem intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse bietet eine langfristige Gewebestabilität, die die Erfassung hochauflösender Bildgebung ermöglicht, um einzelne Inseln bis zu drei Wochen lang zu verfolgen. Das Fenster, das in eine C57 schwarze 6 N Maus mit intravenös injiziertem Anti-CD31-Antikörper implantiert wurde, konjugiert mit einem Alexa 647 Fluorophor, erleichterte die großflächige Bildgebung und vergrößerte die 3D-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse. Acinarzellen wurden in den gemittelten Bildern von Pankreasgewebe im benachbarten Gefäß identifiziert, visualisiert mit Autofluoreszenz bzw. Anti-CD31-Antikörpern.
Mit dem Mosaik-Bildgebungsverfahren, das eine Weitfeldansicht mit hochauflösender Bildgebung kombiniert, wurden etwa 40 bis 50 Inseln mit dem angrenzenden Gefäßsystem in einer MIP-GFP-Maus visualisiert. Eine frühere Studie zeigte, dass Inseln mit dieser stabilen Bildgebungsmethode bis zu drei Wochen lang verfolgt werden können. Um Krebszellen sichtbar zu machen, wurden PANC-1 Nuclite Rote Blutkörperchen während der Operation direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert und nahe gelegene Gefäße wurden mit Anti-CD31 gefärbt, konjugiert mit Alexa 647.
Mit diesem Protokoll wurden Weitfeldbilder von Bauchspeicheldrüsenkrebs erzeugt. Dies trug dazu bei, den Rand des Tumors abzugrenzen und hochauflösende 3D-Bilder auf Einzelzellebene zu erzielen. Der kritischste Schritt bei dieser Methode ist die geschickte Implantation des Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus.
Mit anderen Kombinationen der fluoreszierenden Mauszellen und Antikörpersonden konnte eine dynamische Interaktion benachbarter Zellen mit Entweder Inselchen oder Cancel-Zellen identifiziert werden. Diese Methode kann von denjenigen, die die Veränderung der Insel in verschiedenen pathophysiologischen Zuständen und Mikroumgebungen des Bauchspeicheldrüsenkrebses in situ untersuchen, weit verbreitet sein.
