Diese Arbeit wurde von R01 DK078161 aus NIDDK (LO), Postdoc-Stipendien von der American Heart Association (AB), der Wenner-Gren-Stiftung von Schweden und Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Schweden (UB) unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von Maine Medical Center Research Institute Core Facilities für Histopathologie, Bioinformatik und FACS (unterstützt durch 2P20RR18789-06) und die MMCRI Tierhaltung zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung Reagenzien für die Nieren Verdauung <ol><li> 1,5 ml 0,25% Collagenase A (w / v) und 1% Pankreatin verdauen (w / v) Lösung zur Extraktion von nephrogenen Zone Zellen (NZCs) von 8 E17.5 Nieren notwendig sein. Da Pankreatin dauert ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur zu lösen, genug zu verdauen Lösung für die größte Zahl von embryonalen Nieren erwarten sollte vor dem Versuch erfolgen. Bereiten Analysenlösung durch erste Zugabe von 25 mg Collagenase A bis 10 ml Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) in eine klare 15 ml, steriles Zentrifugenröhrchen. Es ist wichtig, dass die DPBS enthält kein Kalzium oder Magnesium, da dies mit der enzymatischen Verdauung stören. Mix-Lösung auf einem Kolbenpendel für 10 Minuten zu lösen Collagenase A. Add 100 mg Pankreatin aufgelöst Collagenase A-Lösung und mischen auf einem Kolbenpendel für mindestens 2 Stunden. Alternativ können Collagenase A / Pankreatin Analysenlösung auf einem Kolbenpendel gemischt über Nacht bei 4 ° C. Es wird empfohlen, dass Sie eine Maske tragen, wie Collagenase A und Pankreatin leicht zerstreuen in die Atmosphäre während des Wiegens und Nasengänge reizen. </li><li> Bereiten Sie eine 5% fötalem Rinderserum (FBS) (v / v) Lösung in Kochsalzlösung Hank-Lösung (HBSS). Umkehren, um zu mischen. 1 ml für jede Röhre von 8 Nieren notwendig sein wird. </li><li> Bereiten Kulturmedium durch Ergänzung Keratinocyte serumfreiem Medium mit 1% Glutamin (v / v) und 1% Penicillin-Streptomycin (PenStrep) (v / v). </li><li> Coat sterile Flachboden Polystyrol Zellkultur-Platten (96, 48, 24 oder 6 gut) mit humanem Fibronectin-Lösung bei einer Konzentration von 5 mg pro cm 2 des Wachstums Oberfläche. 5 mg Fibronectin-Pulver wird in 5 ml sterilem H 2 O resuspendiert Dies ist 1:25 in steriler DPBS ohne Calcium oder Magnesium verdünnt und 250 ml in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte aufgenommen. Die Platten werden dann mit Fibronektin-Lösung bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit 1 Stunde bei 4 ° C. Alternativ inkubiert und anschließend können Platten über Nacht bei 4 ° C. Die Lösung wird dann in einer Sterilbank abgesaugt vor der Zugabe von Medium / Zellen. </li></ol> 2. Dissecting Nieren &amp; Entfernen von Kapseln (Done bei Raumtemperatur) <ol><li> Am E17.5, Opfer der Mutter mit einem Verfahren durch Ihre Institutional Animal Care und Verwenden gebilligten entfernen die Gebärmutter, und legen Sie sie in eine Petrischale mit DPBS mit Calcium und Magnesium. Unter einem Binokular, verwenden Uhrmacher Pinzette für jeden Embryo aus der Gebärmutter zu entfernen und zu enthaupten jedem Embryo. Sobald der gesamte Wurf ist aus der Gebärmutter, Übertragung der Embryonen auf eine saubere Petrischale mit genug DPBS mit Calcium und Magnesium, um vollständig zu bedecken die Embryonen zu hinterlassen, wie viel Blut und Gewebereste wie möglich. </li><li> Mit einer Pinzette, einen umlaufenden Schnitt in der Bauchwand des Embryos auf der Ebene des Nabels. Dann legen Sie den Embryo auf dem Rücken, Pin es sich bei den Schultern mit einem Satz von Zangen, und entfernen Sie die inneren Organe von der Lunge bis in die Blase mit den anderen Satz von Zangen. Mit der Praxis kann dies in einer Bewegung ausgeführt werden. Die Nieren sollten auf der Rückseite der Masse der Organe beigefügt werden. Wenn die Nieren nicht auf die ausgenommenen Organen verbunden zu tun bleiben, können sie vorsichtig aus der dorsalen Körperwand entfernt werden. Nieren, die in dieser Sektion Prozess beschädigt wurden zu verwerfen, da sie die letzte Kultur mit ungeeigneten Zelltypen verunreinigt werden. </li><li> Gently necken sich die Nieren aus dem Rest der Organe, kümmert sich um die Nieren miteinander verbunden bleiben. Halten Sie das Gewebe zwischen den Nieren mit einer Reihe von Zangen und Greifer der Nebenniere an einer der Nieren mit der anderen Pinzette. Die Nebenniere sollte die Nierenkapsel angebracht werden. Vorsichtig schälen Nebenniere und Kapsel von außen um die Niere, ähnlich Schälen einer Banane. Achten Sie darauf, die Niere in zwei Hälften geteilt, während Peeling, und sicher sein, nicht auf die Nierengewebe unter der Kapsel beschädigt. Entfernen Sie vorsichtig restlichen Kapsel sowie den Harnleiter, ob es noch angebracht ist. Wiederholen Sie mit den verbleibenden Niere. </li><li> Verwenden Sie einen Schnitt Transfer-Pipette in die Nieren in ein 5 ml Polystyrol Röhrchen HBSS Platz. Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,4 für jeden Embryo. Nieren 8. Mai pro Röhrchen gepoolt werden. Mit ein wenig Übung, Dissektion und Kapsel entfernen dauert 2-3 Minuten pro Embryo. </li></ol> 3. Enzymatische Verdauung der Nieren (alle Schritte bei Raumtemperatur Soweit nicht anders angegeben) <ol><li> Entfernen HBSS-Lösung von 5 ml Röhrchen mit Nieren mit einer Pipette, während er vermeidet den Kontakt mit den Nieren. Sofort im 1,5 ml Collagenase A / Pankreatin Analysenlösung in der 5 ml Röhrchen mit Nieren, bevor er nach der nächsten Probe. Wiederholen Sie für jede Röhre der Nieren. </li><li> Die Röhrchen mit Enzym / Niere verdaut auf einem Kolbenpendel in einer vorgewärmten 37 ° C Inkubator für 15 Minuten. 2 Minuten vorAbschluss der Verdauung, fügen Sie 3 ul DNase (1 U / ml) zu einem frischen 5 ml Polystyrol Röhrchen für jeden verdauen durchgeführt wird. </li><li> Schnelles Entfernen verdaut vom Inkubator, fügen Sie 75 ul FBS und invertieren 3 mal zu mischen. Lassen Sie Standplatz auf der Bank für 2 Minuten. </li><li> Übertragen 1,4 ml der Zellsuspension auf die 5 ml Polystyrol Röhrchen mit DNase (1 U / ml), während die restlichen 0,2 ml Zellsuspension und Nieren hinter sich. Die zusätzlichen 0,2 ml Lösung zurückgelassen werden Verunreinigungen wie extrazellulären Matrix enthalten. </li><li> Mix Zellsuspension / DNase auf einem Kolbenpendel in einer vorgewärmten 37 ° C Inkubator für 10 Minuten. </li><li> Schnelles Entfernen Zellsuspensionen von Inkubator und Transfer jeweils mit einer 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. Spin Zellsuspensionen in Mikrozentrifuge bei 325 g für 5 Minuten. </li><li> Remove from Zellpellet und Pellet Überstand in 1 ml 5% FBS / HBSS, Auf-und Abpipettieren von 5 bis 6 mal. Cap jedes Rohr, bevor er nach der nächsten Probe. </li><li> Spin Zellsuspensionen in einer Mikrozentrifuge bei 325 g für 5 Minuten. </li><li> Überstand entfernen und fügen Sie 0,5 ml Keratinozyten serumfreiem Medium (KSFM) mit Zusatzstoffen in jedes Röhrchen und Kapillarrohr, bevor er nach der nächsten Probe. Nach Medium hat zu allen Röhrchen hinzugefügt, vorsichtig resuspendieren jedem Zellpellet durch Auf-und Abpipettieren von 5 bis 6 mal mit einer 1 ml Pipette. Kombinieren Sie alle Zellsuspensionen in einem frischen 5 ml Polystyrol Röhre. </li><li> Vornässen zwei 40 Mikron Zell-Sieb Kappen auf einem 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen mit KSFM pro Probe gestellt. Pass Zellsuspensionen durch eine Zellsieb Kappe durch die Übertragung mit einer 1 ml Pipette. Berühren Sie den Filter mit der Pipettenspitze. Sammeln Flow-Through und wiederholen Filtration durch das zweite Sieb Kappe. Entfernen Sie die Zellsieb Kappe und durch eine neue Mütze aus einer normalen 5 ml Polystyrol Röhre. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder andere Zelle Zähleinrichtung und Transfer-Zellen in die Vertiefungen einer Fibronektin beschichtete Zellkulturplatten mit einer Dichte von 100.000-200.000 Zellen pro cm 2, Verdünnung wie bei KSFM mit Additiven erforderlich. Grundsätzlich rufen wir etwa 4.5x10 6 Zellen pro 10 Embryo Wurf. </li><li> Inkubieren von Zellen in einer 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Lassen Zellen sich zu erholen und legen für 2-4 Stunden in Medium vor der Stimulation mit zusätzlichen Reagenzien. Stimulieren Zellen mit Verbindung von Interesse für 1 bis 48 Stunden. Purify RNA für die PCR-Analyse unter Verwendung des Qiagen RNeasy Micro Kit nach den Anweisungen des Herstellers oder folgen Sie den Anweisungen unten, um fluoreszenzmarkierte immunostain den Zellen. </li></ol> 4. Vorbereitung Reagenzien für die Fixierung der Zellen und Immunfärbung <ol><li> Bereiten Sie 4% PFA: Lösen Sie 4% Paraformaldehyd in PBS (v / v) bei 55 ° C mit regelmäßigen Bewegung. Auf Raumtemperatur abkühlen, bevor verwenden. Diese Lösung ist giftig und sollte nur in dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden. </li><li> Bereiten Permeabilisierung Lösung durch Zugabe von Triton X-100 in PBS um 0,3% (v / v) Lösung zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie einen 5% Blocking-Lösung in PBS mit Serum aus der gleichen Spezies wie wurde verwendet, um den sekundären Antikörper verwendet werden erhöhen. Zum Beispiel, wenn Sie einen Kaninchen-Antikörper gegen Ihre Ziel-Antigen mit einem Esel anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 erkennen wird, bereiten Sie einen Blocking-Lösung mit 5% Esel-Serum. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten primärer Antikörper-Lösung durch Zugabe der entsprechenden Konzentration des Antikörpers bis 5% Blocking-Lösung. </li><li> Bereiten sekundären Antikörper-Lösung unmittelbar vor Gebrauch. Add Fluorophor konjugierten Antikörper in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration zusammen mit der nuklearen Gegenfärbung DAPI und anderen Organellen Marker wie Phalloidin bis 5% Blocking-Lösung. Wenn Speicher benötigt wird, halten Lösung im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie 50% Glycerin / PBS-Lösung (v / v) für die Lagerung von immungefärbt Zellen. Alternativ können Vectashield verwendet werden. </li></ol> 5. Fixierung der Zellen und Immunfärbung <ol><li> Das folgende Protokoll ist für die Fixierung und Färbung von NZCs in einer 24-Well-Platte ausgelegt. Volumes gegeben werden für eine einzige gut. Reagenzien sollte vorsichtig bei allen Schritten zur Ablösung von Zellen zu vermeiden pipettiert werden, und die Platte Agitation ist nicht in der Inkubationsschritte empfohlen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Medium mit einer 1 ml-Mikropipette und 0,5 ml 4% PFA für angebracht kultivierten Zellen. Inkubieren für 15 Minuten ungestört bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen 4% PFA und 0,5 ml pro Vertiefung der Permeabilisierung Lösung. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Permeabilisierung Lösung und schonend zweimal gründlich mit 0,5 ml PBS pro Spülung. </li><li> 0,5 ml Blocking-Lösung und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 Minuten. </li><li> Entfernen Blockierungslösung und fügen 0,225 ml Primärantikörper-Lösung. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen primärer Antikörper-Lösung und sanft rinse zweimal mit 0,5 ml PBS pro Spülung. </li><li> Add 0,225 ml sekundären Antikörper-Lösung. Inkubieren Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 60 Minuten. </li><li> Entfernen sekundären Antikörper-Lösung und schonend zweimal gründlich mit 0,5 ml PBS pro Spülung. </li><li> Fügen Sie 0,3 ml 50% Glycerin / PBS-Lösung (v / v) oder genug Vectashield nach unten gut bedecken. </li><li> Bild Zellen mit Epifluoreszenzmikroskop oder lagern in Folie verpackt bei 4 ° C. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. NZCs wurden von E17.5 Embryonen gereinigt, vernickelt auf 200.000 Zellen pro cm 2 und bei 37 ° C für insgesamt 24 Stunden. Die Zellen wurden durch Phasenkontrast mit einem Leica DM IRB inverse Mikroskop vor Immunfluoreszenzfärbung abgebildet. (A) 20X Phasenkontrast Blick NZCs nach 24 Stunden in Kultur. (B) wurden die Zellen fixiert und gefärbt mit einem Kaninchen-Anti-PAX2 Antikörper, der spezifisch für Nephron Vorläuferzellen (rot) und eine sekundäre Alexa Fluor 568 konjugierten Esel-anti-Rabbit. Hinweis blauen Kerne gegengefärbt mit DAPI. (C) 40X Phasenkontrast Blick auf eine Gruppe von Nephron Vorläuferzellen (zentriert) nach 24 Stunden in Kultur. (D) 40X Bild NZCs von LacZ + Embryonen von Foxd1 LacZ-Stamm, der β-Galactosidase exprimiert unter der Kontrolle des Foxd1 Promotor. Foxd1 isoliert ist in den Stromazellen Bevölkerung innerhalb der nephrogenen Zone des sich entwickelnden Niere exprimiert. Die Zellen wurden mit dem F-Aktin-Marker Phalloidin (Oregon green primäre Konjugat), der Kernfärbung DAPI (blau) und Kaninchen-anti-β-Galaktosidase gefärbt (sekundäre - Alexa Fluor Esel-anti-Rabbit 568) für den Nachweis von Foxd1 + Stromazellen ( rot).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem nephrogenen Zone der embryonalen Niere. Es ist die Entwicklung einer Methode zunächst als Teil einer Studie über die Auswirkungen der BMP7 Behandlung auf Zellen des nephrogenen Zone (Blank et al., 2009) veröffentlicht. In der ersten Studie wurden eine Reihe von Experimenten, die Zelltypen innerhalb der NZC Bevölkerung vertreten charakterisieren durchgeführt. Kurz gesagt, Reinigung von NZCs aus genetischen Re...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

Embryonalentwicklung der Niere wurde ausgiebig sowohl als Modell für die epithelial-mesenchymale Interaktion in der Organentwicklung und das Verständnis für die Ursprünge der angeborenen Nierenerkrankungen zu gewinnen untersucht. In jüngerer Zeit hat die Möglichkeit der Steuerung naiv embryonalen Stammzellen in Richtung nephrogenen Schicksale in dem aufstrebenden Gebiet der regenerativen Medizin erforscht. Genetische Studien in der Maus haben mehrere Wege für Nieren-Entwicklung erforderlich identifiziert, und einen globalen Katalog der Gen-Transkription in die Orgel wurde vor kurzem generiert <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> und bietet zahlreiche Kandidaten Regulatoren der wesentlichen Entwicklungs-Funktionen. Organogenesis der Nagetier-Niere kann in Organkultur untersucht werden, und viele Berichte haben diesen Ansatz verwendet, um die Ergebnisse der beiden Kandidaten die Anwendung Proteine ​​oder klopfen Sie den Ausdruck von Kandidatengenen mittels siRNA oder Morpholinos analysieren. Allerdings ist die Anwendbarkeit der Organkultur dem Studium der signalisiert, dass Stammzellen / Vorläuferzellen Zelldifferenzierung gegenüber Erneuerung regelt in den Entwicklungsländern Niere begrenzt, da kultivierten Organe einer kompakten extrazellulären Matrix Diffusionsgrenzstrom von Makromolekülen und Viruspartikel enthalten. Um die Zelle Signalwege, die den Stamm / Progenitorzellen Nische in der Niere haben wir eine primäre Zelle, das die nephrogenen Zone oder Progenitorzellen Nische der Entwicklung von Niere ex vivo isoliert von der epithelialen Induktor der Differenzierung schafft entwickelt haben Einfluss zu studieren. Mit begrenzten enzymatische Verdauung, können nephrogenen Zone Zellen selektiv befreit von sich entwickelnden Nieren bei E17.5. Nach der Filtration, können diese Zellen als eine unregelmäßige Monoschicht mit optimierten Bedingungen kultiviert werden. Marker-Gen-Analyse zeigt, dass diese Kulturen eine Verteilung von Zelltypen Merkmal der nephrogenen Zone in vivo enthalten, und dass sie unterhalten geeignete Marker-Gen-Expression während der Kulturzeit. Diese Zellen sind sehr zugänglich für kleine Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die erleichtert das Studium der Kandidat Stamm / Progenitorzellen Regler Effekte. Grundlegende zellbiologische Parameter wie Proliferation und Zelltod sowie Veränderungen in der Expression von molekularen Markern Merkmal Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen in vivo erfolgreich als experimentellen Ergebnissen verwendet werden. Laufende Arbeiten in unserem Labor mit Hilfe dieser neuartigen primären Zelle Technik zielt darauf ab, die grundlegenden Mechanismen für die Regulierung von Selbst-Erneuerung im Vergleich Differenzierung in Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen aufzudecken.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der Progenitorzellen Nische aus der embryonalen Maus-Niere, die verwendet werden, um Signalwege Regulierspindel / Vorläuferzellen des sich entwickelnden Nieren untersucht werden können. Diese kultivierten Zellen sind sehr zugänglich kleines Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die einer effizienten Handhabung von Kandidaten Wege ermöglicht.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Aufrufe.  Maine Medical Center Research Institute. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der Progenitorzellen Nische aus der embryonalen Maus-Niere, die verwendet werden, um Signalwege Regulierspindel / Vorläuferzellen des sich entwickelnden Nieren untersucht werden können. Diese kultivierten Zellen sind sehr zugänglich kleines Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die einer effizienten Handhabung von Kandidaten Wege ermöglicht.

Serie: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...