Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Nierenerkrankung zu beantworten. Vor allem im Verständnis des Glomerulus in normalen und kranken Zuständen. Glomeruläre Biologie kann aufgrund der Vielfalt der vorhandenen Zelltypen und ihrer einzigartigen Struktur schwierig zu studieren sein.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, mit einfachen Methoden und Geräten eine leicht verfügbare Quelle für intakte Glomeruli zu schaffen. Diese Technik hat Auswirkungen auf unser Verständnis der Filtrationsbarriere in der normalen und kranken Niere. Insbesondere kann es Licht auf unser Verständnis von proteinurc chronischen Nierenerkrankungen, bei denen glomeruläre Verletzungen führt zu der ungewöhnlich hohen Sekretion von Serumproteinen in den Urin.
Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik neu sind, Schwierigkeiten haben, eine angemessene Ausbeute und Reinheit in der endigen Probe zu erhalten. Demonstriert wird das Verfahren von Brittney Rush, einer Technikerin aus meinem Labor. Um zu beginnen, verwenden Sie Haarschneider, um Haare aus dem vorderen Bauch einer eingeschläferten Ratte zu entfernen.
Verwenden Sie 70% Ethanol, um die exponierte Haut zu reinigen. Dann, mit chirurgischer Schere, machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut. Um innere Organe freizulegen, machen Sie einen Mittellinienschnitt durch die Muskelschicht.
Suchen und isolieren Sie die Nieren und legen Sie sie in ein steriles 50 Milliliter Kunststoffkonusrohr mit 30 Millilitern Hanks gepufferter Salzlösung oder HBSS auf Eis. Übertragen Sie die Röhre auf Eis auf eine sterile Zellkulturhaube. Übertragen Sie die Nieren auf eine sterile Petrischale mit fünf Millilitern HBSS auf Eis gelegt.
Verwenden Sie Schere und scharfe Zange, um Perirenalfett zu entfernen und zu entsorgen. Um die Kapseln rund um die Niere zu entfernen und zu entsorgen, machen Sie einen kleinen oberflächlichen Schnitt und verwenden Sie dann scharfe Zangen, um sie sanft von der Niere wegzuziehen. Legen Sie die Nieren auf eine sterile Gaze in einer zweiten Petrischale mit fünf MilliliterHBSS und teilen Sie jede Niere in der Hälfte durch einen mittelsagittalen Abschnitt.
Verwenden Sie ein Skalpell, um die Medulla zu entfernen und zu entsorgen, die durch ihre dunklere Farbe und zentrale Lage identifiziert werden kann. Die restlichen Stücke, die überwiegend den Nierenrinde enthalten, in eine dritte Petrischale mit fünf Millilitern HBSS übertragen. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um sie zu zerkleinern, bis die Stücke weniger als einen Millimeter groß sind oder bis eine Paste gebildet wird.
Verwenden Sie 1%BSA PBS, um die Ober- und Unterseite eines 180 Mikrometer Siebs über ein 500-Milliliter-Abfallbecher zu befeuchten. Dieser Schritt ist entscheidend, da er das Sieb mit Protein beschichtet und die Haftung von Glomeruli reduziert, was dann die Ausbeute verbessert. Legen Sie den gemischten Kortex auf eine kleine Kante des Siebes.
Verwenden Sie den strukturierten Kolbenflansch einer 10 Milliliter Einwegspritze, um das Gewebe durch das Sieb in eine auf Eis gelegte Unterpfanne zu spülen. Spülen Sie regelmäßig mit HBSS so wenig wie möglich, um Probenverdünnung zu vermeiden und wiederverwenden die Flüssigkeit sammeln in der unteren Pfanne, um das Sieb zu spülen. Nach dem fertigen Sieben den Boden des Siebs vorsichtig mit HBSS von der Unterseite der Pfanne waschen, um lose haftete Glomeruli einzufangen.
Teilen Sie die gesamte Flüssigkeit aus der unteren Pfanne in 10-Milliliter-Spritzen mit 20-Spur-Nadeln. Die Flüssigkeit mindestens dreimal durch die Nadel in die untere Pfanne geben. Für die letzte Sammlung die glomeruli enthaltende Flüssigkeit in der Spritze aufbewahren, bis sie bereit ist, sie durch das 90 Mikrometer Sieb zu passieren.
In der Zwischenzeit die untere Pfanne waschen, indem Sie sie mit 1%BSA PBS und in ein Abfallbecher spülen. Verwenden Sie 1%BSA PBS, um die Ober- und Unterseite eines 90 Mikrometer Siebes zu befeuchten und dann auf die Oberseite der unteren Pfanne zu legen. Tragen Sie die Probe in den Spritzen auf eine Kante des Siebs auf.
Verwenden Sie einen strukturierten Kolbenflansch, um das Gewebe wie zuvor durch das Sieb zu spülen. Verwenden Sie die Lösung aus der unteren Pfanne, um das Gewebe zu waschen und sammeln Sie alles von einer Kante des Siebs. Sobald das Sieben abgeschlossen ist, waschen Sie den Boden des Siebs vorsichtig mit einem HBSS-Puffer von der Unterseite der Pfanne, um alle Glomeruli zu erfassen, die lose haften.
Sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit aus der unteren Pfanne in einem 50 Milliliter Kunststoff konischen Rohr. Verwenden Sie 1%BSA PBS, um die untere Pfanne in ein Abfallbecher zu waschen. Verwenden Sie dann 1%BSA PBS, um die Ober- und Unterseite eines 75 Mikrometer Siebs zu befeuchten.
Legen Sie das Sieb auf die untere Pfanne auf Eis gelegt. Tragen Sie die Probe auf eine Kante des Siebs mit Flüssigkeit, die leicht durchfließt. Spülen Sie die Oberseite des Siebes mit mindestens 20 Millilitern von 1%BSA PBS in ein Becherglas und waschen Sie vorsichtig den Boden des Siebes.
Um die Glomeruli zu sammeln, die oben auf dem 75 Mikrometer Sieb verblieben sind, spülen Sie das Sieb kopfüber mit so viel HBSS wie nötig ab, um Glomeruli in einer Petrischale zu sammeln. Sammeln Sie die gesiebten Glomeruli in einem 50 Milliliter Kunststoff konischen Rohr auf Eis. Nach der Zentrifugierung bei 1800 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
Das Pellet in 10 Milliliter kaltem HBSS wieder aufhängen. Kombinieren Sie die Proben und wiederholen Sie die Zentrifugation. Setzen Sie die Glomeruli in fünf Milliliter HBSS wieder aus.
Um die gesamten Glomeruli zu zählen, legen Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen der Probe auf eine Glasrutsche, zählen unter dem Mikroskop und mehrere um 500, um den Gesamtertrag zu erhalten. Isolierte Strukturen sollten aus fast allen Glomeruli ohne röhrenförmige Strukturen bestehen. Wenn Tubuli vorhanden sind und Ihre nachgelagerte Anwendung beeinträchtigen würden, können sie entfernt werden, indem die gesamte Probe auf das 90-Mikrometer-Sieb aufgebracht und das Protokoll ab diesem Zeitpunkt wiederholt wird.
Das hier beschriebene Protokoll ist effizient bei der Isolierung von Glomeruli und die Endsuspension ist dicht mit Glomeruli mit einer Reinheit von mehr als 95% und einer minimalen Kontamination durch Röhrensegmente oder andere Zelltypen bestückt. Diese Glomeruli können mit Hämatoxylin- und Eosinflecken gefärbt werden, um ihre Morphologie zu sehen. Darüber hinaus behalten sie ihre Struktur während des gesamten Protokolls auch nach der Verarbeitung bei.
Sie behalten intakte und lebensfähige Podozyten, mesangiale Zellen und Endothelzellen. Die isolierten Glomeruli wurden chemischen Verletzungen ausgesetzt, um in vivo Pathologie zu simulieren. Insbesondere Protaminsulfat, das die Ladung der glomerulären Filtrationsbarriere stört.
Im Gegensatz zu gesunden Glomeruli, Protaminsulfat behandelt Glomeruli, haben eine deutliche Reduktion von Nephron und eine Reihe von Kernen positiv für WT1. Bei der Transmissionselektronenmikroskopie zeigen gesunde Glomeruli typische Fußprozesse. Nach der Behandlung von Protaminsulfat werden Fußprozesse längs oder ausgelöscht, was auf eine Podozytenverletzung hindeutet.
Um die Zelllebensfähigkeit in isolierten Glomeruli zu bestimmen, wurde die gespaltete Kaspase drei als Apoptose-Marker beobachtet. Es gab keine geballte Kaspase drei bei Null und eine Stunde nach der Isolierung von Glomeruli. Einige Zellen zeigten Anzeichen einer Apoptose bei zwei und vier Stunden mit einer fortschreitenden Zunahme im Laufe der Zeit.
Die größte Anzahl von apoptotischen Zellen wurden mit 24 und 48 Stunden festgestellt. Basierend auf diesen Ergebnissen empfehlen wir, für die meisten Experimente sofort nach der Isolierung isolierte Glomeruli zu verwenden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, schnell und effizient zu arbeiten.
Von dem Moment an, in dem die Niere isoliert ist, beginnen sich Glomeruli zu verschlechtern. Je schneller Sie die Glomeruli isolieren, desto mehr Zeit haben Sie zu posieren, Isolation, Manipulation. Nach der Isolierung können isolierte Glomeruli chemischen oder biologischen Arbeitsstoffen ausgesetzt werden, um physiologische oder pathologische Bedingungen zu stimulieren.
Und Proben können Prozess verfahren für Protein- oder RNA-Isolation, Histologie oder Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie sein. Seit ihrer Entwicklung in den 1950er Jahren hat diese Technik Forschern beim Studium der Glomerularbiologie unterstützt. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Methode zur Bewertung der morphologischen und zellulären Eigenschaften intakter Glomeruli in normalen und kranken Zuständen.
Diese Methode kann uns helfen, die chronischen Nierenerkrankungen von Proteinururic zu verstehen und bei der Entwicklung zukünftiger Therapien zu helfen.
