Die Aktivierung von parietalen Epithelzellen ist ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von Narbengewebe im Glomerulus der Niere. Mit dieser Methode können wir die zellulären Prozesse untersuchen, die an dieser Aktivierung beteiligt sind, und hoffentlich Behandlungsmöglichkeiten finden, um das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder sogar zu stoppen. Der Hauptvorteil unserer Technik ist, dass wir Primärzellen verwenden, die direkt aus den isolierten Glomeruli wachsen.
Nach der Befreiung der Nieren, wie im Textmanuskript beschrieben, halten Sie die Niere mit den chirurgischen Zangen und verwenden Sie ein anderes Paar Zangen, um die Nierenkapseln abzuziehen. Danach legen Sie die Nieren in die Brunnen einer sechs Brunnenkulturplatte, die jeweils zwei Milliliter HBSS enthalten und legen Sie die Kulturplatte auf Eis. Zuerst übertragen Sie die Nieren auf eine 100-Millimeter-Petrischale und verwenden Sie zwei Skalpelle, um sie in kleine Stücke zu zerkleinern, die etwa ein bis zwei Millimeter groß sind.
Die gehackten Nierenstücke mit HBSS nass halten. Als nächstes legen Sie die Nierenstücke auf ein 300 Mikrometer Metallsieb und drücken Sie die Niere durch das Sieb mit dem Kolben aus einer 20 Milliliter Spritze. Spülen Sie das Sieb mit HBSS dazwischen wiederholt aus und verwenden Sie eine serologische Pipette, um den Durchfluss zu sammeln und in eine saubere Petrischale zu übertragen.
Verwenden Sie ein Skalpell, um alles abzukratzen, was im Boden des Siebes verbleibt, und übertragen Sie es auf das gesammelte Nierenhomogenat. Spülen Sie die Niere durch ein 75- und 53 Mikrometer-Sieb mit HBSS. Waschen Sie dann beide Siebe mit HBSS, um alle kleineren Strukturen zu entfernen.
Sammeln Sie die Nierenstrukturen und das Material, das in den Sieben verblieb, indem Sie die Obere Oberfläche von jedem mit DMEM ergänzt mit 20%fetalen Kalbsserum waschen und das Material in die Brunnen einer sechs gut ultra-niedrigen Befestigungsmikroplatte übertragen. Bringen Sie die ultra-niedrige Befestigungsmikroplatte zu einem invertierten Lichtmikroskop und verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, die einzelne verkapselte und oder entkapselte Glomeruli sammelt. Nach dem Fangen eines einzigen Glomerulus in der Pipettenspitze, fügen Sie frisches DMEM-Medium ohne gesammeltes Nierenmaterial in die gleiche Pipettenspitze zu einem Volumen von 20 Mikrolitern.
Übertragen Sie den einzelnen Glomerulus mit dem DMEM-Medium in die Mitte eines Brunnens einer 24 Brunnenkulturplatte und brüten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei Stunden, um die Befestigung des Glomerulus an der Mitte des Brunnens zu ermöglichen. Nach der Inkubation wird der Glomerulus an der Mitte des Brunnens befestigt. Fügen Sie vorsichtig 500 Mikroliter endotheliale Basal Medium mit einem Wachstumsfaktor-Kit und einem zusätzlichen 5%FBS und 1%Penicillin und Streptomycin zu jedem Brunnen ergänzt.
Kultur die einzelnen Glomeruli bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für sechs Tage. Verwenden Sie nach sechs Tagen Inkubation ein digitales invertiertes Lichtmikroskop, um Bilder zu machen und das glomeruläre Wachstum zu analysieren. Bestimmen Sie mithilfe einer Bildanalysesoftware die Oberfläche des glomerulären Auswuchses, indem Sie eine der Bilddateien mit einer Maßstabsleiste öffnen.
Zeichnen Sie eine gerade Linie auf der Maßstabsleiste, und klicken Sie auf Analysieren, und messen Sie dann, um den Abstand in Pixeln zu bestimmen. Um den Maßstab zu bestimmen, klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Skalierung, und geben Sie die bekannte Entfernung in Pixeln, die bekannte Entfernung und die Längeneinheit ein. Klicken Sie auf Okay, wenn Sie fertig sind.
Klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen. Überprüfen Sie dann die Optionen für Bereich und Anzeigebeschriftung. Klicken Sie auf Okay, wenn Sie fertig sind.
Als nächstes zeichnen Sie eine Freihandauswahl um das glomeruläre Auswuchs. Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um eine Ergebnistabelle anzuzeigen, die die Fläche des Auswachsens in der zuvor ermittelten Skala enthält. in dieser Studie werden die glomerulären parietalen Epithelzellauswüchse von verkapselten Glomeruli aus Mausnieren isoliert, kultiviert und analysiert.
Repräsentative Lichtmikroskopiebilder zeigen die glomerulären Auswüchse zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur, nachdem der Glomerulus von den Mausnieren isoliert wurde. Um zu bestätigen, dass es sich bei den auswachsenden Zellen um parietale Epithelzellen handelt, werden entkapselte Glomeruli ebenfalls sechs Tage lang isoliert und kultiviert. Entkapselte Glomeruli zeigen während dieser Inkubationszeit kein Zellwachstum.
Immunfluoreszenzfärbung wird dann für verschiedene parietale Epithelzellmarker, fotostandortspezifische Marker sowie endotheliale Zellmarker durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigen, dass die auswachsenden Zellen tatsächlich parietale Epithelzellen sind. Glomeruli, die von CD44-Knockout-Mäusen assoziiert werden, zeigen eine verringerte Anzahl von auswachsenden Zellen sowie eine verringerte Oberfläche des glomerulären Auswuchses im Vergleich zu den Glomeruli, die von Wildtypmäusen isoliert wurden.
Dies deutet auf eine wichtige Rolle für CD44 bei der parietalen Epithelzellaktivierung hin. Mit dieser Technik, Es ist auch möglich, die Auswirkungen auf Medikamente auf parietale Epithelzellaktivierung zu studieren. Dies kann durch die Behandlung der isolierten Glomeruli mit dem Medikament Ihrer Wahl und die Unterschiede im Zellwachstum und Zellmigration zu analysieren.
