Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Funktion der Muskelfasern zu bewerten. Darüber hinaus kann es für Arzneimittel-Screening-Studien verwendet werden, die darauf abzielen, die Muskelgesundheit zu verbessern. Mit dieser Technik kann die Kontraktilität einer großen Anzahl von Muskelfasern in relativ kurzer Zeit isoliert und gemessen werden, ohne dass ein fortgeschrittenes Training erforderlich ist.
Die Zusammensetzung der Hydrogele kann verändert werden, um die Wirkung von Umweltreizen sowohl in gesunden als auch in kranken Muskeln zu bestätigen. Der schwierigste Teil des Eingriffs ist die anfängliche Dissektion des Muskels. Wenn nicht genügend Sorgfalt aufgewendet wird, kann eine Schädigung des Muskels zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Muskelfasern führen.
Das Verfahren wird von Leander Vonk, einem Forschungstechniker, und Osman Esen, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, den unteren Hinterschenkel der eingeschläferten Maus direkt über dem Knöchel zu schneiden. Machen Sie einen Schnitt auf der Haut auf der dorsalen Seite des Fußes in Richtung Zehen.
Schälen Sie die Haut vorsichtig zu den Zehen hin und achten Sie darauf, den Muskel nicht zu beschädigen. Legen Sie den präparierten Fuß in eine Robbenschutzschale mit 10 Millilitern vorgewärmtem Präpariermedium bei 37 Grad Celsius. Stecken Sie den Fuß durch die Haut, die noch an den Zehen befestigt ist.
Fixieren Sie den Unterschenkel über den Knöchel hinaus und entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe auf der Oberseite des Muskels. Durchtrennen Sie die Sehne an der Ferse und heben Sie den Muskel an. Schneiden Sie entlang und unter dem Muskel durch das Bindegewebe, bis die Zehensehnen freiliegen.
Schneiden Sie die Sehnen durch, wenn die Hälfte der Länge von drei Sehnen freiliegt. Lösen Sie den Muskel vom Fuß und spannen Sie die Sehnen der FDB-Muskeln an. Entfernen Sie das restliche Bindegewebe aus dem Muskel.
Übertragen Sie das gereinigte Muskelgewebe in ein Röhrchen mit vorgewärmtem Präpariermedium. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um den Brevis-Muskel in ein Röhrchen zu übertragen, das das Muskelverdauungsmedium enthält. Legen Sie das Gewebe 80 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator.
Übertragen Sie den Muskel in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern Präpariermedium. Pipettieren Sie den Muskel mit vorbereiteten Verreibungsspitzen vom größten zum kleinsten und setzen Sie die Verreibung fort, bis sich die Muskelfasern von der Sehne gelöst haben. Die Sehnen können mit einer P200-Spitze entfernt werden.
Die dissoziierten Muskelfasern werden in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Präpariermedium überführt. Lassen Sie die Fasern 20 Minuten im Inkubator ruhen, bis sich ein Pellet gebildet hat. Pipettieren Sie vorsichtig das gesamte Medium von der Oberseite des Faserpellets.
Auf dem Eis resuspendieren Sie die Zellen in 875 Mikrolitern Zellmischung pro Muskel. 125 Mikroliter Matrixzellmischung in Röhrchen mit 125 Mikrolitern Zellsuspensionsaliquot geben. Mischen Sie durch sanftes Pipettieren, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
Übertragen Sie die endgültige Mischung sofort in eine Vertiefung. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Muskelfasern unter dem Mikroskop. Legen Sie die Gele für 30 bis 45 Minuten in einen Inkubator, um die Erstarrung zu fördern.
Wenn Sie fertig sind, geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter Nährmedium in jede Vertiefung. Schalten Sie das optische kontraktile Messsystem, die Leuchtstofflampe, den Schrittmacher und den Computer ein. Stellen Sie den elektrischen Stimulator auf 1,0 Hertz bei 10 Volt mit einer Impulsdauer von fünf Millisekunden ein, um die isolierten Muskelfasern zu stimulieren.
Setzen Sie die Platte in das Messsystem ein. Schließen Sie den Schrittmacher an den Einsatz an und setzen Sie ihn in die Kulturplatte ein. Öffnen Sie das Programm IonWizard.
Klicken Sie auf OK. Öffnen Sie eine neue Datei, indem Sie auf das Dateisymbol und dann auf Neu klicken. Wählen Sie Experiment sammeln aus, um zu überprüfen, ob sich das Programm auf dem richtigen Skelettsarkomer des Experiments befindet. Um das Experiment zu ändern, klicken Sie auf das gewünschte Experiment und drücken Sie dann auf Hinzufügen.
Wenden Sie die Einstellungen SARC 20X, durchschnittliche Leitungen, einzelne FFT, 250 Hertz Abtastrate und eine Erfassungszeit von 10 Sekunden an. Ändern Sie die Temperatur des Messsystems auf 25 Grad Celsius. Klicken Sie auf den Open Cell Finder, um ein neues Bildschirm-Popup zu erstellen.
Wählen Sie den Plattentyp und die aktiven Vertiefungen aus. Fokussieren Sie die Fasern, indem Sie den Fokus-Schieberegler anpassen. Aktivieren Sie die Stimulation, um eine elektrische Stimulation zu induzieren, und beobachten Sie das Zucken der Fasern.
Halten Sie die Sarkomere im Fokus und stellen Sie sicher, dass der Messbereich am Faserende so fixiert ist, dass die Sarkomere vertikal verlaufen. Wenn die Sarkomere fokussiert sind, ist in der Symbolleiste ein einzelner Peak sichtbar, der sich bei der Kontraktion nach rechts bewegt. Messen Sie die Fasern auf dem Messsystem.
Klicken Sie auf Start, um das Experiment zu starten. Drücken Sie die Q-Taste, um mit der Messung von 10 Kontraktionstransienten zu beginnen. Wenn mehr als vier Transienten rauschfrei aussehen, akzeptieren Sie die Messung durch Drücken der Z-Taste.
Wenn die Transienten zu viel Rauschen enthalten, lehnen Sie die Messungen ab. Drücken Sie Stopp, um das Fenster des Zellfinders zu schließen, sobald das Experiment abgeschlossen ist. Speichern Sie die Datei und erstellen Sie eine neue Datei.
Öffnen Sie das Programm CytoSolver Desktop, klicken Sie auf Importieren und wählen Sie die zu analysierenden Dateien aus. Identifizieren Sie nach Abschluss der Analyse die blauen, roten und grauen Spitzen. Klicken Sie auf Exportieren.
Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Durchschnitt zu vorübergehenden Daten, und exportieren Sie nach Excel. Ein höherer Prozentsatz an verwertbaren kontraktilen Muskelmessungen wurde im 3D-Fibrin-Hydrogel erzielt, da es seitliche Bewegungen und andere Einflussfaktoren verhinderte. Die Fasereinbettung hatte keinen signifikanten Einfluss auf die maximale Kontraktionsgeschwindigkeit oder die Sarkomerverkürzung.
Es wurde eine verminderte Kontraktion in der reinen Basalmatrix beobachtet, die wahrscheinlich auf eine Gelsteifigkeit oder eine erhöhte Interaktion mit der Zellmatrix zurückzuführen ist. In ähnlicher Weise reduzierte die Einbettung der Basalmatrix auch die Verkürzung des Sarkomers im Vergleich zum Fibrin-Hydrogel. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die isolierten Muskelfasern ziemlich zerbrechlich sind und besonders darauf geachtet werden sollte, sie beim Pipettieren nicht zu beschädigen.
Nach dem Isolationsverfahren können auch Methoden wie Immunfärbung, Protein- und RNA-Isolierung durchgeführt werden. Die Entwicklung dieser Technik hat neue Möglichkeiten eröffnet, die Funktion reifer Muskelfasern im Hochdurchsatz zu untersuchen.
