This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

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	<li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation.">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li><li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy.">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li><li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r., Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears.">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li><li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths.">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers.">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li><li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution.">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li><li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human.">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li><li>Gollapudi, S. K., Lin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+determination+of+sarcomere+force-length+relationship+in+type-1+human+skeletal+muscle+fibers.">Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers.</a> J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).</li><li>Brenner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+stabilizing+the+striation+pattern+in+maximally+calcium-activated+skinned+rabbit+psoas+fibers.">Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers.</a> Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).</li><li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans.">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li><li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats.">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li><li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+human+muscle:+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level.">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li><li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training.">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li><li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+human+muscle+fibers+after+short-term+resistance+exercise+training.">Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training.</a> Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).</li><li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+spaceflight,+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology.">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li><li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics.">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li><li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029.">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li><li>Russell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+fast+skeletal+muscle+troponin+as+a+potential+therapeutic+approach+for+treating+neuromuscular+diseases.">Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases.</a> Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).</li><li>Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+function+and+rate+of+disease+progression+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).</li><li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice.">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li><li>Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-induced+injury+to+single+permeabilized+muscle+fibers+from+mdx,+transgenic+mdx+and+control+mice.">Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).</li><li>Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+high-resolution+separation+of+rodent+myosin+heavy+chain+isoforms+in+a+mini-gel+electrophoresis+system.">Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system.</a> Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).</li><li>Hill, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+of+shortening+and+the+dynamic+constants+of+muscle.">The heat of shortening and the dynamic constants of muscle.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).</li><li>Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-velocity+properties+of+human+skeletal+muscle+fibres:+myosin+heavy+chain+isoform+and+temperature+dependence.">Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence.</a> J Physiol. 495, 573-586 (1996).</li><li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres.">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li><li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+force+generation+in+muscle:+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution.">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li><li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit.">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li><li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle.">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li><li>Ashley, C. C., Moisescu, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+changing+the+composition+of+the+bathing+solutions+upon+the+isometric+tension-pCa+relationship+in+bundles+of+crustacean+myofibrils.">Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils.</a> J Physiol. 270, 627-652 (1977).</li><li>Godt, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-activated+tension+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.+Dependence+on+magnesium+adenosine+triphosphate+concentration.">Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li><li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells.">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles).">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li><li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li><li>Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+lattice+spacing+change+on+cross-bridge+kinetics+in+chemically+skinned+rabbit+psoas+muscle+fibers.">The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers.</a> Biophys J. 64, 187-196 (1993).</li><li>Millman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+filament+lattice+of+striated+muscle.">The filament lattice of striated muscle.</a> Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).</li><li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers,+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers.">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li><li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+isometric+force,+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle.">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li><li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat.">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li></ol>

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Beurteilungen der kontraktilen Eigenschaften permeabilisierter einzelnen Skelettmuskelfasern werden verwendet, um die Muskelfunktion in einer Vielzahl von Kontexten zu untersuchen. Beispiele hierfür sind Studien, die die Auswirkungen der Alterung 12 ausgewertet haben, ausüben 10,13,14, Raumfahrt 15, Verletzungen 2,3,16, medikamentöse Behandlungen 17,18, 19 und Krankheit genetische Manipulation 20,21 auf Faserstruktur und Funktion. Aufgrund der Fähigkeit, direkt die kontraktilen Leistung Myofibrillen in ihrer Mutter Konfiguration, bietet diese Technik eine attraktive Plattform, um ein Verständnis der Funktion myofibrillären abwesend potenziell verwirrende Effekte, die vorhanden sind zu bilden, wenn die neuromuskuläre Signalübertragung und Anregung induzierte Calciumfreisetzung sind in der untersuchten Systems enthalten. Weiterhin kann die Funktionsprüfung der Einzelfasern verwendet werden, um kontraktilen Proteinidentifikationsergebnisse wie jene ergänzendurch Immunhistochemie oder Gelelektrophorese + Western-Blot-22 erhalten. Eine der primären Funktionen der Skelettmuskel ist, um eine Kraft zu erzeugen. Folglich sF o, ein Maß für die intrinsischen Krafterzeugungsfähigkeit eines kontraktilen Systems ist von großem Interesse, um die Muskel Physiologen. Zuverlässige Schätzungen der sF o erfordern genaue Maßnahmen beider Faser CSA und F o. Da Fasern sind in der Regel weder einen kreisförmigen Querschnitt, noch gleichmäßiger in CSA entlang ihrer Länge, große Sorgfalt sollte bei der Schätzung CSA genommen werden. Zu diesem Zweck werden die Messungen an mehreren Stellen entlang der Länge der Faser hergestellt und an jedem Ort, von zwei Seiten um 90 ° getrennt sind. Zuverlässige Maßnahmen der F o erfordern Aufmerksamkeit auf einige Details, einschließlich Buchhaltung für passive Kraft, die Anpassung Sarkomerlänge Überschneidungen von dicken und dünnen Fäden zu maximieren, unter Verwendung einer Aktivierungslösung mit einem Calciumkonzentration tKappe ergibt maximalen Aktivierung, die Aufrechterhaltung der gewünschten Versuchstemperatur und Aufrechterhaltung einer optimalen Lagerbedingungen (Temperatur und Dauer) der Fasern vor dem Tag des Experiments. Während die hier beschriebenen Schritte beschreiben das Verfahren zur Bewertung maximale isometrische Kraft, ist es häufig wünschenswert, andere wichtige funktionelle Eigenschaften der Skelettmuskelfasern bewerten. Dies kann durch Verstrecken des experimentellen Protokolls, um zusätzliche mechanische Manipulationen der Faser schließen erreicht werden. Zum Beispiel ermöglicht die Messung der Geschwindigkeit, mit der die Faser verkürzt gegen eine Reihe von unterschiedlichen Lasten Bestimmung des Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung, aus der Kraft-Kraft und Geschwindigkeitsleistungsverhältnisse berechnet 10,23,24 werden. Zusätzlich kann die Geschwindigkeit der entladenen Verkürzung durch Verwendung des &quot;slack-Test&quot; 25, die der Anwendung einer Reihe von Durchhang-induzierende Verkürzung Schritte und measuri bestehen bestimmt werdenng die Zeit von der Faser erforderlich den Durchhang zu entfernen. Eine weitere kinetische Parameter, die häufig berichtet wird, ist k tr, die Geschwindigkeitskonstante für Kraft Sanierung nach einer mechanischen Störung, die vorübergehend löst alle Querbrücken 26. Schließlich ist die Beziehung zwischen der Calciumkonzentration und der aktiven Krafterzeugung (der &quot;Kraft-PCA relationship&quot;) oft von Interesse 18 und kann durch Aussetzen der Faser einer Reihe von Lösungen mit Calciumkonzentrationen im Bereich von unterhalb der Schwelle für die Aktivierung des kontraktilen bestimmt werden System, um solche ausreichende maximale Aktivierung und damit maximale Kraft (F o) zu entlocken. Obwohl ein Großteil der genannten Gerätes ist für die Bewertung der einzelnen Faser Kontraktilität benötigt wird, ist anderen Geräten nicht unbedingt erforderlich. Das Längen-Controller, beispielsweise ist für jede experimentelle Protokoll, das eine schnelle und genaue Verlängerung oder Verkürzung der Faser erfordert,aber nicht für die Bewertung maximalen isometrischen Kraft (wenn auch ein Nullkraftniveau in der Kraft-Eintrag muss immer noch auf irgendeine Weise identifiziert werden kann) unbedingt erforderlich. Die Prismen, die Beobachtung der Faser von der Seite zu erlauben, während die für die Beurteilung Querschnittsfläche, sind nicht unbedingt notwendig, wenn die Positionierung der Faser in der Experimentierkammer. Weiterhin sind Mittel zum alternativen Freilegen der Fasern zu den verschiedenen Versuchslösungen verwendet werden könnten, einschließlich der Konzipierung einer manuell betriebenen System von Kammern oder einer Kammer, die für ein schnelles Füllen gestattet und Entleeren von Lösungen. Schließlich, während subphysiologischen experimentellen Temperaturen wie 15 ° C werden häufig verwendet, um die Reproduzierbarkeit der mechanischen Messungen 1,2,3,5,8,12,17,27 verbessern, ist es möglich, gültige Daten bei anderen Temperaturen 23 erzeugen , 28, solange die Wirkungen der Temperatur auf die Lösungseigenschaften (Calciumkonzentration, pH, etc.) berücksichtigt werden. </p&gt; Die Zusammensetzung der Testlösungen zu den kritischsten Aspekte der hier beschriebenen Techniken permeabilisierten Faser. Überlegungen zu Lösungszusammensetzung sind komplex und würde den Rahmen dieses Artikels sprengen. Das in Schritt 5 des Protokolls beschrieben Lösungen werden mit Betonung auf eine schnelle Aktivierung des permeabilisierten Faser bei der Übertragung vom voraktiviert, um Aktivierungslösungen, während eine konstante Ionenstärke, kationische Zusammensetzung und Osmolarität 6,29 ausgelegt. Andere Ansätze zur Lösungszusammensetzung wurden mit großem Erfolg von anderen Forschungsgruppen tätig und nutzen veröffentlicht Bindungskonstanten und Computational Tools 27,30,31 Regel. Die Konzentrationen von Calciumionen in den verschiedenen Aktivierungslösungen ist insbesondere in Studien mit submaximale Aktivierung wie Kraft-PCA Auswertungen. Für Experimente, in denen die Fasern vollständig aktiviert werden, wie jene, beschriebend hier die Calciumkonzentration in der Aktivierungslösung übersteigt typischerweise mit einem komfortablen Vorsprung, die maximale Kraft zu erzielen, was seine genaue Kenntnis weniger kritisch notwendig. Zusatz von Kreatinphosphat ist für die Pufferung der intramyofibrillar ATP und ADP Schwankungen, die sonst mit kontraktile Aktivität verbunden wäre. Kreatinkinase erforderlich ist, um den Phosphattransfer von Kreatinphosphat zu ADP katalysieren. Unter Versuchsbedingungen, die in hoher ATP Umsatzraten, einschließlich der Arbeit bei hohen Temperaturen oder Messen von Hochgeschwindigkeits-Backfett in die schnellen Fasern 32 führen kann, müssen Kreatinkinase zu der Lösung gegeben werden, um die endogenen Creatin-Kinase, die gebunden an die Faser bleibt zu ergänzen. Für weniger anspruchsvolle experimentellen Bedingungen ist der ATP-Regenerationssystem 27 weniger kritisch. Einschränkungen der permeabilisierten Einzelfaser-Technik sind die folgenden. Die von diesen Tests generierten Daten bestimmen diekontraktilen Eigenschaften des spezifischen myofibrillaren Einheit, die mit der experimentellen Vorrichtung befestigt war. Folglich fängt diese nur einen kleinen Teil des gesamten mehrkernige Faser aus dem das Segment wurde erhalten, der wiederum nur einen kleinen Teil der Gesamtzahl von Fasern in den Muskel. Die Ermittler sollten daher sorgfältig überlegen, die erforderlich ist, um irgendwelche Schlüsse aus den Versuchen ausge unterstützt Sampling. Zusätzlich Bewertung der Auswirkungen der Übung Trainingsintervention auf Faser-Funktion setzt voraus, dass die ausgewerteten Fasern wurden in der Tat während der Ausbildung rekrutiert. Obwohl das Protokoll versucht, den natürlichen intrazellulären Milieu der Faser imitieren, ist die sarcolemma Permeabilisierung Verfahren unspezifisch und notwendigerweise ermöglicht lösliche intrazelluläre Bestandteile frei in den Badelösungen diffundieren. Eine weitere Folge der Membranpermeabilität einer Änderung des osmotischen Gleichgewichts durch eine Schwellung des Faservolumens 33 sichtbar. DieFaserquellung erhöht den Abstand zwischen Aktin und Myosin-Filamente was zu einer verringerten Calciumempfindlichkeit des myofilament System 34,35, kann aber durch die Einführung von großen, osmotisch wirksame Verbindungen 34 umgekehrt werden. Eine letzte Einschränkung zu betrachten ist die Folge der Technik verwendet, um Fasern zu der experimentellen Vorrichtung zu befestigen. Dies erfordert unweigerlich eine Verzerrung der räumlichen Beziehung innerhalb des Fadensystem an und nahe den Befestigungspunkten, mit Teilnahme an Funktionsdefizite. Insbesondere werden die Bereiche der Faser an und benachbart zu den Befestigungspunkten funktional beeinträchtigt und dadurch artifactual Serie Elastizität mit dem Messsystem bei. Zusammenfassend haben wir ein Mittel, mit dem die Krafterzeugungskapazität des chemisch permeabilisiert Skelettmuskelfasern in vitro zu beurteilen, beschrieben. Obwohl der Schwerpunkt dieses Artikels hat sich auf die Bewertung der maximalen isometrischen Kraft generatin geweseng Kapazität des menschlichen Skelettmuskelfasern kann der experimentelle Ansatz modifiziert und erweitert, um eine Vielzahl von kinetischen Parameter und Beziehungen in einer Reihe von Arten, von Säugetieren oder anderweitig zu bestimmen.

Die primäre Funktion der Skelettmuskel ist, um eine Kraft zu erzeugen. Muskelkraft wird in vivo durch eine komplexe Abfolge von Ereignissen, die motorischen Nervenaktionspotentiale, die neuromuskuläre Übertragung, Muskelfaseraktionspotentiale, die Freisetzung von intrazellulärem Calcium, und die Aktivierung des Systems der Regulierung und kontraktilen Proteine ​​enthält ausgelöst. Da Krafterzeugung ist das ultimative Ergebnis dieser Sequenz könnte ein Defizit in Kraft, die durch Ausfall eines oder mehrerer der einzelnen Stufen verursacht werden. Ein Schlüsselattribut der permeabilisierten Faservorbereitung ist, dass es beseitigt die meisten der für die Krafterzeugung in vivo erforderlichen Schritte, mit nur den regulatorischen und kontraktilen Funktionen mit der myofibrillären Gerät restlichen verbunden. Der Prüfer übernimmt die Kontrolle über die Lieferung der Aktivierung Calcium und Energie (ATP), und ist mit einem vereinfachten System, die Beurteilung der isolierten regulatorischen und kontraktilen Strukturen können in ihrer Mutter co belohntnfiguration. Messungen der Stärke mit permeabilisierten Skelettmuskelfasern sind somit wertvolle bei der Beurteilung Veränderungen in vivo beobachtet Muskelfunktion. Zum Beispiel haben wir diese Technik verwendet, um die Krafterzeugungskapazität von Fasern von Myostatin-defizienten Mäusen 1 zu charakterisieren und um die Ursache der anhaltenden Muskelschwäche folgende chronische Rotatorenmanschette 2,3 ausgestellt zu bewerten. Moderne permeabilisiert Faser Methodik kann früh einflussStudien 4,5 verfolgt werden und ist derzeit in Gebrauch von einer Reihe von Forschungsgruppen. Obwohl die Techniken in der Literatur beschrieben worden sind, haben sie noch nicht im Videoformat präsentiert. Das Ziel dieses Artikels ist es, um eine aktualisierte, gültige und zuverlässige Technik für die Messung der maximalen Krafterzeugungskapazität von einzelnen Fasern aus chemisch permeabilisiert Skelettmuskel-Proben zu veranschaulichen. Dazu ist eine individuelle Fasersegment (nachfolgend als ein voll ̶0; Faser &quot;) aus einem vorge permeabilisiert Faserbündel herausgezogen und in einer Versuchskammer, die eine entspannende Lösung eingebracht, von denen das bestimmende Merkmal eine Calciumkonzentration, &lt;10 nM. Die Faser wird dann an einem Ende mit einer Kraft-Wandler und mit dem anderen Ende an einem längen Controller angeschlossen sind. Mit der Faser in einer optimalen Sarkomerlänge gehalten wird, wird es einer aktivierenden Lösung, die eine Calcium-Konzentration, die ausreicht, um eine maximale Aktivierung und damit eine maximale isometrische Kontraktionskraft hervorrufen übertragen hat. Kraftdaten werden erfasst, gespeichert und mit einem Computer analysiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Gesund, chemisch permeabilisiert Einzelfasern sollten einheitlich in der Form erscheinen und konsistente Streifenabstand unter hoher Vergrößerung betrachtet. Fasern, die unflexibel sind, wenn sie mit der Zange oder manipuliert haben offensichtliche strukturelle Schäden zu verwerfen. Hohe Vergrößerung digitaler Bilder im Schritt 15 aufgenommen werden 5 gepaart Durchmessermessungen entlang der Mittelteil der Faser analysiert. Faser CSA wird unter Annahme eines elliptischen Querschnitt aufweist und durchschnittlich 5 einzelnen CSA-Messungen, wie in 7A dargestellt. 7B dient auch dazu, zu veranschaulichen, wie Faserabmessungen in einer Ansicht kann signifikant verschieden im Vergleich zu Partner Abmessungen in der anderen Ansicht (dh grenz Abschnitte nicht im allgemeinen rund). Vergleichskraft Spuren aus menschlichen langsamen und schnellen Fasern werden in den 8A und 8B gezeigt. Voltage Ausgabe der Kraft-Wandler während eines Tests erfasst und umgewandelt zu zwingen (MN) mit Datenerfassungs- und Analysesoftware (LabVIEW). 9 veranschaulicht die Vorgehensweise verwendet, um maximale Wirkkraft (F o) zu bewerten, die durch Subtraktion berechnet wird die erforderlich ist, um die Faser zu optimalen Sarkomerlänge pflegen Kraft, während in einem entspannten Zustand (passive Kraft F P), von der größten isometrische Kraft während maximal Faseraktivierung entwickelt (Gesamtkraft F T). Da der Ausgang der Kraftwandler, der auf Null Kraft entspricht, ist in der Regel für jede der verschiedenen Badekammern wir kurz zu entspannen die Faser sowohl in der Pre-aktivierenden und Aktivierungslösungen, um die Null-Kraftniveau in der Capture- experimentellen Datensatz. Normalisierung der maximalen Wirkkraft, die durch Faser CSA dient dazu, die mehr Aussagekraft bestimmten Kraft (SF o) zu erzeugen. Denn es berücksichtigt die CSA der Faser, SF o </sub&gt; liefert ein Maß für die intrinsische Krafterzeugungskapazität des kontraktilen Apparates der Faser, wodurch eine funktionale Vergleiche zwischen Fasern von unterschiedlichen Größen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass CSA-Messungen sind nicht möglich, den Anteil der Faser durch kontraktile Filamente gegenüber dem Anteil von anderen subzellulären Strukturen besetzte unterscheiden. Typische Eigenschaften von gesunden, erwachsenen Fasern von Claflin et al. 2011 10 Menschen, Mendias et al. 2011 1 für Maus und Gumucio et al. 2012 2 für Ratten sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Daten in Tabelle 3 wurden unter Verwendung der erzeugten Techniken, die in diesem Artikel beschrieben. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Mensch (Vastus lateralis) </strong&gt; </td><td> Maus (EDS) </td><td nowrap="nowrap"> Ratte (Infraspinatus) </td></tr><tr><td colspan="2"> Männlich </td><td colspan="2"> Weiblich </td><td> Männlich </td><td> Männlich </td></tr><tr><td> Typ-1- </td><td> Typ 2a </td><td> Typ-1- </td><td> Typ 2a </td><td> (Nicht eingegeben) </td><td> (Nicht eingegeben) </td></tr><tr><td> CSA (&amp; mgr; m 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (MN) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Typische Merkmale von gesunden, erwachsenen Fasern aus menschlichem vastus lateralis 10, Maus extensor digitorum longus 1 und Ratte infraspinatus 2 Muskeln. Optimal Sarkomer Längen wurden mit 2,7 &amp; mgr; m für die menschliche Fasern 7,8 und 2,5 &amp; mgr; m sowohl für Maus (36 gesetzt, 37) und Ratten-Fasern (38). Experimental L f Bereiche (25. und 75. Quartile) waren 1,39 bis 1,73 mm, 1,17 bis 1,53 mm und 1,32 bis 1,59 mm für Mensch, Maus und Ratte sind. Bereiche gezeigt zeigen die 25. und 75. Quartile und n die Anzahl der getesteten Fasern. Die häufigsten Probleme während der Prüfung umfassen eine Fadenschleife Schlupf, der in einem Kraft respons Ergebnissee mit einem &quot;fangen&quot;, wie es in 10A dargestellt ist, und eine teilweise oder vollständige Dicke Reiß der Faser, die in einer Reaktion, die Kraft schlagartig in Richtung oder, um (Pause) gibt Ergebnisse Null, während die Faser noch im Aktivierungslösung eingetaucht (10B). Wenn während eines Experiments ein Schlupf, Riss oder Bruch auftritt, sollte die Faser verworfen werden und die Daten ausgeschlossen, obwohl die Aufrechterhaltung einer Aufzeichnung der Faserausfälle können auch informative 11 sein. Ein weiteres negatives Ergebnis, die angetroffen werden kann, ist die vorzeitige Aktivierung der Faser, während in der Pre-aktivierende Lösung (Abbildung 10C). Teilaktivierung in der Pre-Aktivierungslösung schlägt erhebliche grenzüber gut Kontamination (dh eine unbeabsichtigte Erhöhung der Kalziumkonzentration in der Pre-Aktivierung auch). In diesem Fall sollten alle Bäder abgesaugt und gut mit deionisiertem Wasser gespült werden. Trocknen der Teilungsoberflächen zwischen den Kammern ist auch Empded wie Feuchtigkeit oder Kondensation in diesen Bereichen können zu Feuchtigkeitsregulierung der Lösung zwischen den Bädern führen. Die Entscheidung über die ein- oder ausgeschlossen werden Daten hängt letztlich von der experimentellen Fokus und sollte daher bei der Auslegung der Studie werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Abbildung 1: Nähfadenschlaufe (10-0 Monofilament-Nylonnaht). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Abb. 2: Bundle Dissektion Zange sind in der linken Hand, sind Mikrodissektion Schere in die rechte Hand. Rote Linie gibt die günstige Orientierung des Handgelenks und der Schere, wobei die Längsachsen der Fasern. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Abbildung 3: </strong&gt; (A) Prüfgerät mit markierten Komponenten. (A) Versuchskammern mit transparenten Böden. (B) Length-Controller. (C) Kraft-Wandler. (D) Lichtquelle. (E) Length-Controller xyz Mikrometerschraube mit digitaler Anzeige. (F) Bühnenmikrometerschraube mit digitaler Anzeige. (G) Kraft-Wandler xyz Mikrometerschraube. (H) Plattform für kalibrierten Laserbeugungszielbildschirm. (I) Schwingungsisolierung Tisch. (B) Close-up Blick auf die Versuchskammern. (J) Edelstahl-Befestigungsfläche, die sich von der Länge-Controller. (K) Edelstahl-Befestigungsfläche, die sich von dem Kraftwandler. (L) Side-View-Prisma. (M) Gehäuse für thermoelektrische Kühlmodulen. (N) Thermoelement für die Berichterstattung Kammer temperatur. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Abbildung 4: Modifizierte 100 ul Pipettenspitze verwendet werden, um Fasern aus Dissektion Gericht zu Versuchskammer übertragen. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Abb. 5: Montage einzelnen Faser auf Versuchsvorrichtung (A) Nahtschlaufen auf Edelstahl-Befestigungsflächen eingefädelt. (B) Fiber übertragen Experimentierkammer. (C) Fiber to Edelstahlbefestigungsflächen durch das erste Paar von Nahtschleifen mit überschüssigen Faden entfernt verankert. (D) zweites Paar Nahtschlaufen über die Oberseite des ersten Nahtschleifen Gewinde und gebunden an Ort und Stelle. <img alt="Figur 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Abbildung 6: Sarkomerlänge wird durch die Projektion eines Laserinterferenzmuster auf einer kalibrierten Zielbild beurteilt (a) Laser-Quelle.. (B) Spiegel. (C) Zielbild. (D) Laserinterferenzmuster. <img alt="7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Abbildung 7: (A) Bestimmung der Faserquerschnittsfläche zu optimalen Sarkomerlänge (human = 2,7 um). Unter der Annahme eines elliptischen Querschnitts wird CSA für jede der fünf Positionen entlang der Fasermittelteil und dem Mittelwert der fünf Einzelmessungen als Faser CSA berichtet berechnet. 2a für Aufsicht und Durchmesser ist<html> einer Achse der Ellipse, 2b darstellt Seitenansicht Durchmesser und die andere Achse der Ellipse. (B) Repräsentative Faserabbildungen zur Darstellung jeder der fünf entsprechenden Durchmessermessungen sowohl in der Aufsicht und Seitenansicht genommen. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Abbildung 8: Repräsentative Kraft Spuren von gesunden menschlichen M. vastus lateralis Fasern (A) Typ 1 Faser (CSA: 5710 &amp; mgr; m 2, F o: 0,89 mN und SF o: 156 kPa).. (B) Typ 2a Faser (CSA: 9510 &amp; mgr; m 2, F o: 1,66 mN und SF o: 174 kPa). Faser-Myosin schwere Kette-Typ wurde durch die Verwendung von elektrophoretischen Trennung und Silber-Färbetechniken 22 bestimmt. oad / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Abbildung 9: Berechnung der maximalen Wirkkraft (F o) (a) erweiterte Ansicht des Faserkraftantwort bei slack-induzierende Bewegung des Länge-Controller in der Vor-Aktivierungslösung eingeleitet.. F P die erforderlich ist, um eine Sarkomerlänge von 2,7 um mit der Faser in Ruhe zu halten Kraft. (B) vergrößerte Ansicht Länge-Controller slack-induzierende Bewegung. Beachten Sie, dass F o = F T - F P. <img alt="10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Abbildung 10: (A) Fadenschleife Schlupf, durch ein &quot;Fang&quot; in Kraft Spur während des Anstiegs von Gewalt zeigt. Überprüfen Sie, ob Schleifen sind vor der Aktivierung der Faser sicher. (B) Faserbruch während der Aktivierung. Kann während der Fadenschleife Ort aufgrund der schlechten Faserintegrität oder aggressive Faserbehandlung seinment. (C) Eine vorzeitige Teilfaseraktivierung durch Verschmutzung von Pre-Aktivierungskammer mit Ca 2+.

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Die Analyse der Kontraktionseigenschaften von chemisch gehäutet oder durchlässig gemacht, Skelettmuskelfasern bietet ein leistungsfähiges Mittel, um die Muskelfunktion auf der Ebene der einzelnen Muskelzelle zu bewerten. In diesem Artikel beschreiben wir eine valide und zuverlässige Technik für die Vorbereitung und Prüfung durchlässig gemacht Skelettmuskelfasern in vitro.

Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K Aufrufe.  University of Michigan Medical School.  Die Analyse der Kontraktionseigenschaften von chemisch gehäutet oder durchlässig gemacht, Skelettmuskelfasern bietet ein leistungsfähiges Mittel, um die Muskelfunktion auf der Ebene der einzelnen Muskelzelle zu bewerten. In diesem Artikel beschreiben wir eine valide und zuverlässige Technik für die Vorbereitung und Prüfung durchlässig gemacht Skelettmuskelfasern in vitro. 

Serie: Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Die Messung der Aggregate Zusammenhalt durch Gewebeoberfläche Tensiometrie

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Herstellung der lichtreaktions Membranen durch eine Kombinierte Oberflächen-Pfropfen und Postmodification Prozess

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.