Mikrofluidische Geräte, die zur Unterteilung von Neuronen verwendet werden, sind zu einem Standardwerkzeug in der Neurowissenschaft geworden, das es Forschern ermöglicht, subzelluläre Regionen von Neuronen wie Somata, Axone, Dendriten und Synapsen physisch und chemisch zu manipulieren. Diese abgeschotteten Kulturgeräte können helfen, zahlreiche Fragen im bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. wie axons sich während der Entwicklung zu Synapsen ausdehnen, wie Synapsen nach Axonschäden umbauen und reformieren und wie sich pathologische Bedingungen bei Krankheiten wie Alzheimer transsynaptisch ausbreiten können. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von vormontierten Kunststoff-Multifach-Chip für die Kompartimierung Kultur primäre Ratte Neuronen.
Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Chips ist, dass sie eine einfach zu bedienende und hoch reproduzierbare Methode bieten, um Neuronen zu unterteilen. Ein weiterer Vorteil ist, dass diese Chips ein gesünderes, langfristiges Wachstum von Neuronen und isolierten Axonen als frühere, auf Silizium basierende kompartalisierte Geräte liefern und gleichermaßen mit hochauflösender Mikroskopie kompatibel sind. Andere Modellsysteme, einschließlich menschlicher Stammzellen, können auch innerhalb des vormontierten Kompartimentbauchips kultiviert werden.
Um zu beginnen, legen Sie einen sterilen, Multi-Fach-Chip in eine Petrischale. Fügen Sie 100 Mikroliter einer Vorcodierungslösung in den oberen linken Brunnen des Chips und lassen Sie ihn durch den Hauptkanal in den angrenzenden Brunnen fließen. Als nächstes füllen Sie den unteren linken Brunnen des Chips mit 100 Mikroliter der Vorcodierungslösung.
Warten Sie dieses Mal fünf Minuten, damit die Lösung durch die Mikrorillen fließen kann. Fügen Sie nun 100 Mikroliter der Vorcodierungslösung zum oberen rechten Brunnen hinzu und lassen Sie ihn durch den Hauptkanal in den angrenzenden Brunnen fließen. Nach 90 Sekunden die untere rechte Seite gut mit 100 Mikrolitern der Vorcodierungslösung füllen und den Chip 10 Minuten lang inkubieren.
Winkeln Sie die Pipettenspitze vorsichtig vom Hauptkanal ab und aspirieren Sie die Lösung von jedem Brunnen aus. Dann sofort 150 Mikroliter PBS in den oberen linken Brunnen geben und anderthalb Minuten warten. Als nächstes fügen Sie 150 Mikroliter PBS in den unteren linken Brunnen und warten Sie fünf Minuten, damit die Flüssigkeit durch die Mikrorillen fließen kann.
Fügen Sie dann 150 Mikroliter PBS in die oberen rechten und unteren rechten Brunnen, in dieser Reihenfolge hinzu. Nach 10 Minuten das PBS wieder ansaugen und die Waschschritte ein zweites Mal wiederholen. Nach der zweiten Wäsche, aspirieren Sie die PBS aus den Brunnen wie zuvor durch Angeln der Pipettenspitze, weg von der Kanalöffnung.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter 0,5 Mischung pro mil Poly-D-Lysin Lösung, um die obere linke Bohrung des Chips. Warten Sie anderthalb Minuten und füllen Sie dann die untere linke gut mit 100 Mikroliter der Poly-D-Lysin-Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der rechten Hälfte des Chips.
Schließen Sie die Petrischale. Dann legen Sie den Chip in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Inkubation spülen Sie den Chip zweimal mit PBS, wie zuvor beschrieben.
Als Nächstes aspirieren Sie die PBS vom Gerät. Sofort 100 Mikroliter Zellkulturmedien in den linken oberen Brunnen des Chips geben. Nach eineinhalb Minuten, fügen Sie Medien auf der unteren linken Gut.
Warten Sie fünf Minuten, bis die Medien durch die Mikrorillen fließen können, und wiederholen Sie dann den Füllvorgang auf der rechten Seite des Chips. Bereiten Sie eine Zellsuspension von dissoziierten Ratten-Hippocampus-Neuronen nach etablierten Protokollen vor. Entfernen Sie die Mehrheit der Medien in jedem Brunnen des Chips, aber lassen Sie die Kanäle gefüllt.
Als nächstes sofort fünf Mikroliter der Zellsuspension in den oberen rechten Brunnen und weitere fünf Mikroliter Zellsuspension in den unteren rechten Brunnen laden. Zeigen Sie beim Laden der Zellen die Spitze der Pipette auf den Hauptkanal. Nach dem Laden der Zellen, übertragen Sie den Chip auf eine Mikroskopstufe und stellen Sie sicher, dass sich die Neuronen im Hauptkanal befinden.
Nachdem Sie fünf Minuten gewartet haben, bis sich die Zellen anheften, fügen Sie etwa 150 Mikroliter neuronaler Kulturmedien zu jedem der oberen und unteren rechten Brunnen hinzu. Fügen Sie dann 150 Mikroliter Medien zu jedem der oberen und unteren linken Brunnen hinzu. Bedecken Sie die Petrischale und legen Sie den Chip in einem befeuchteten Tablett in einem 5% Kohlendioxid, 37 Grad Celsius Inkubator.
Entfernen Sie zunächst 20 Mikroliter aus dem unteren linken Brunnen des Axonfachs und legen Sie ihn in den oberen rechten Brunnen des somatischen Fachs. Warten Sie zwei Minuten, bis der Fluss innerhalb jedes Kanals ausgeglichen wird. Als nächstes entfernen Sie 50 Mikroliter Medien aus dem axonalen Fach, und fügen Sie 0,3 Mikroliter eines Millimolaren Alexa Fluor 488 Hydrazid zu diesem Medium hinzu.
Pipette nach oben und unten, um die Lösung zu mischen und dann das Medium mit dem Fluoreszenzfarbstoff zurück in das axonale Fach zurück. Legen Sie an dieser Stelle den Chip nach Belieben auf das Mikroskop und das Bild. Um eine Axotomie innerhalb des Chips durchzuführen, entfernen Sie zuerst die Medien aus dem Axonfach, wobei die Pipettenspitze vom Eingang des Hauptkanals weggehalten wird.
Bewahren Sie die entfernten Medien vorerst in einem Zentrifugenrohr auf. Als nächstes stellen Sie die Aspirationspipette in der Nähe, entweder Eingang des Hauptkanals des Axonfachs und saugen Sie das Axonfach vollständig an. Fahren Sie fort, um den Bereich für ein bis zwei Minuten zu aspirieren.
Ersetzen Sie das Axonfach durch das gespeicherte Medium. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig aus dem Fach entfernt wird und die Axone durch einen Blick auf die Probe unter dem Mikroskop abgetrennt werden. Dann decken Sie den Chip ab und geben Sie ihn an den Inkubator zurück.
Um mit der Fluoreszenz-Immunostainierung zu beginnen, entfernen Sie die meisten Medien aus dem Chip, sodass die Innenfächer hydratisiert bleiben. Sofort 100 Mikroliter Fixierlösung in die oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer geben. Nach einer Minute 100 Mikroliter Fixierlösung in die unteren Brunnen geben und die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur fixieren.
Entfernen Sie den größten Teil der Lösung aus den Brunnen und fügen Sie sofort 150 Mikroliter PBS zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer hinzu. Warten Sie zwei Minuten, bis die PBS in die unteren Brunnen fließt, entfernen Sie dann die PBS und spülen Sie die Brunnen zweimal mit diesem Verfahren. Nach der letzten Spülung, entfernen Sie die meisten der PBS aus den Brunnen des Chips und sofort fügen Sie 150 Mikroliter PBS mit 0,25%Triton x-100 zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatische Fächer.
Warten Sie 15 Minuten und dann, entfernen Sie den größten Teil der Flüssigkeit aus den Brunnen. Sofort 150 Mikroliter Blockierlösung in jeden der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer hinzufügen. Nach 15 Minuten den größten Teil der Flüssigkeit aus den Brunnen entfernen und sofort 100 Mikroliter der primären Antikörperlösung in jede der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer geben.
Bedecken Sie den Chip, um die Verdunstung zu minimieren, und inkubieren Sie die Zellen im primären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes spülen Sie den Chip, indem Sie den größten Teil der Lösung entfernen und sofort 150 Mikroliter PBS zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und sematischen Fächer hinzufügen. Nach fünf Minuten die PBS aus beiden Brunnen entfernen und die Spülung noch zwei Mal wiederholen.
Entfernen Sie nun den größten Teil der Flüssigkeit aus den Brunnen und fügen Sie sofort 100 Mikroliter Sekundärantikörper in PBS, zu jedem der oberen Brunnen der axonalen und somatischen Fächer hinzu. Bedecken Sie den Chip, um die Verdunstung zu minimieren, und inkubieren Sie den Chip für eine Stunde bei Raumtemperatur. Wie bereits gezeigt, spülen Sie den Chip dann dreimal mit PBS, montieren und kartieren Sie die Chips, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.
Hier ist ein Vergleich von Neuronen auf Kunststoffchips und PDMS-Geräten zu sehen. Neuronales Wachstum ist innerhalb der beiden Plattformen bis zu 15 Tage in der Kultur vergleichbar, aber in längeren Kulturzeitaltern, isolierte Axone innerhalb des Plastikchips, erscheinen gesünder mit weniger Schlag. Um Axone in den Axonfächern weiter zu visualisieren, wurden diese Proben auch für Beta-Tubulin III immunstainiert, das ein gesundes axonales Wachstum innerhalb der Kunststoffchips nach 22 Tagen in der Kultur zeigt.
Weitere Färbung mit 24-Tage-Proben zeigt Neuronen in den Kunststoff-Chips gewachsen, um sowohl die erregenden und hemmenden synaptischen Marker auszudrücken, vGlut1 und vGat. Hier sind die beiden synaptischen Marker kombiniert mit retrograd markierten mCherry Neuronen. Um die Eignung dieses Chips für Axonverletzungen und Regenerationsstudien zu demonstrieren, wurden retrograde markierte Neuronen vor und 24 Stunden nach der Axotomie abgebildet.
Eine Retraktionsbirne und regenerierendes Axon sind beide nach der Axotomie offensichtlich. Diese Ergebnisse entsprechen veröffentlichten Daten mit PDMS-basierten Geräten. Klassische Multi-Fach-Chips bieten eine einfach zu bedienende Option zur Abteilung von Neuronen, die langfristige Neuronenkulturen bereitstellen, die länger als drei Wochen lebensfähig bleiben.
Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, eine angemessene Anzahl von Neuronen zu säen und sicherzustellen, dass Ihr Inkubator während der Kultur gut befeuchtet ist.
