Mitochondrien sind essentiell für die neuronale Gesundheit. Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen sind axonale Mitochondrien die ersten, die leiden, aber es ist nicht klar, was axonale Mitochondrien so besonders macht. Der fluidische Druckgradient in den in diesem Protokoll verwendeten Kammern ermöglicht die selektive Behandlung von Mitochondrienaxonen.
Dadurch bleiben die Prozesse des Zellkörpers ungestört und wir können uns auf die axonale Biologie konzentrieren. Wir zeigen hier die Depolarisation von Mitochondrien mit einem membranpotentialempfindlichen Farbstoff, aber diese Methode kann auf viele verschiedene neuronale Zelltypen und Fluoreszenzanzeigen angewendet werden. Legen Sie zunächst die codierten sechs Brunnenplatten in eine sterile Haube und waschen Sie sie zweimal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser.
Lassen Sie die Platten drei bis fünf Minuten in geneigter Position trocknen. Entfernen Sie überschüssiges Wasser durch Vakuumsaugen oder Pipettieren. Dann die mikrofluidische Kammer in 80% Ethanol einweichen.
Trocknen Sie die mikrofluidische Kammer erneut drei bis fünf Minuten in einer geneigten Position und entfernen Sie überschüssiges Ethanol mit einer Pipettenspitze. Wenn sie vollständig trocken ist, platzieren Sie die mikrofluidische Kammer in der Mitte des Vertiefungs und der Platte. Klopfen Sie vorsichtig auf die mikrofluidische Kammer an ihren Rändern und den Mikronutabschnitt in der Mitte, um sie ordnungsgemäß an der Glasplatte zu befestigen.
Sammeln Sie zunächst die gewünschte Anzahl dissoziierter Hippocampus-Neuronen in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000 mal G für vier Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in acht Mikrolitern B-27 Neuro-Basalmedien.
Anschließend wird die Zelllösung in den Kanaleingang der mikrofluidischen Kammer dosiert. Tippen Sie auf die Rückseite der Platte, um den Fluss durch den Kanal zu unterstützen. Asspirieren Sie mit einer Pipette die verbleibende Zellsuspension am Ausgang des Kanals.
Inkubieren Sie die mikrofluidische Kammer mit Zellen für 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Als nächstes füllen Sie die obere axonale Vertiefung mit 50 Mikrolitern neurobasalem B-27-Medium und klopfen Sie auf die Rückseite der Platte, um den Fluss zu unterstützen. Füllen Sie jede Vertiefung auf der Soma-Seite mit 150 Mikrolitern B-27 neurobasaler Medien, wodurch oben eine Spannungsblase entsteht.
Füllen Sie auch beide Vertiefungen der axonalen Seite mit jeweils 100 Mikrolitern B-27 neurobasaler Medien. Stellen Sie nach sieben bis acht Tagen In-vitro-Kultur sicher, dass die Axone durch die Mikrorillen gewachsen sind und sich in das axonale Kompartiment ausgedehnt haben. Waschen Sie das Gerät, indem Sie das neurobasale Medium B-27 entfernen und 100 Mikroliter vorgewärmtes Bildmedium in die oberen Vertiefungen des axonalen und des Somakanals geben.
Lassen Sie das Medium zu den unteren Vertiefungen durchfließen. Entfernen Sie das Medium aus den unteren Vertiefungen und das übrig gebliebene Medium aus den oberen Vertiefungen und wiederholen Sie den Vorgang mit frischem Medium, wobei die Vertiefungen am Ende der Wäsche leer bleiben. Dann fügen Sie 100 Mikroliter fünf nanomolare TMRE-Verdünnung sowohl in die somatischen als auch in die axonalen oberen Vertiefungen hinzu.
Lassen Sie das Medium durch beide Kompartimente fließen, bis in allen Vertiefungen ein gleiches Volumen vorhanden ist. Füllen Sie das TMRE-haltige Medium auf. Wählen Sie eine Region von Interesse im somatischen Kompartiment und folgen Sie ihr durch die Mikrorillen in das axonale Kompartiment.
Stellen Sie sicher, dass die in den somatischen und axonalen Kompartimenten abgebildeten Mikrorillen aufeinander abgestimmt sind. Nachdem Sie den Dateinamen geändert haben, erfassen Sie rote Fluoreszenzbilder mit 561 Nanometern Anregung und 625 Nanometer Emissionswellenlängen. Stellen Sie einen Volumenunterschied zwischen den Soma- und Axonalkammern sicher, indem Sie das Vorhandensein einer Spannungsblase auf der somatischen Seite überprüfen.
Entfernen Sie dann das Bildmedium aus beiden Vertiefungen der axonalen Seite, mit Ausnahme des Mediums innerhalb des Kanals. Um eine mitochondriale Depolarisation zu induzieren, fügen Sie 160 Mikroliter 20 Mikromolar Antimycin A, verdünnt im Bildmedium in die obere axonale Vertiefung. Lassen Sie es durch den Kanal fließen, bis in beiden axonalen Vertiefungen ein gleiches Volumen vorhanden ist.
Wiederholen Sie die Bildgebung und stellen Sie sicher, dass die gleichen Positionen wie bei der Baseline-Aufnahme abgebildet werden, indem Sie die Mikrorillen identifizieren. Mit diesem Protokoll wurden primäre Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräten gezüchtet, gefolgt von einer mitochondrialen Färbung mit einem membranempfindlichen Farbstoff, TMRE. Eine homogene Färbung der Mitochondrien wurde auf beiden Seiten der Mikrorillen beobachtet, jedoch nicht in der Mitte.
Bei Zugabe von Antimycin A auf der axonalen Seite behielten die somalen Mitochondrien das TMRE-Signal bei, während die Fluoreszenz von den axonalen Mitochondrien verloren ging Stellen Sie sicher, dass keine Feuchtigkeit im Brunnen oder auf dem Gerät zurückbleibt, bevor Sie das Gerät zusammenbauen. Andernfalls werden die Kammern nicht versiegelt. Mit dieser Methode können wir die Auswirkungen des Verlusts der mitochondrialen Funktion im Axon und in lokalen Funktionen sowie deren Einfluss auf die retrograde Signalübertragung und das globale Zellüberleben untersuchen.
Lange Zeit wurde angenommen, dass die mitochondriale Biogenese ausschließlich im Zellkörper stattfindet. Diese Methode ermöglichte es uns, zu zeigen, dass die Schädigung der axonalen Mitochondrien eine lokale Translation des Proteins PINK1 erfordert.
