Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) gewähren # 1R21MH085267 unterstützt.

Teil 1: Vorbereiten eines Master-Form für mehrere Brandabschnitte Neuron Co-Kultur Bauelementherstellung <ol><li> Erster Schritt zum PMMA Master herzustellen ist bis 3,5 mm tief Fächer zu machen. Ein soma Fach und sechs Axon / Glia Fächer sind auf einem PMMA-Block mit einem Mikro-Fräsmaschine (MDX-40, Roland oder andere CNC-Fräsmaschine) definiert. PMMA-Master ist dann in Isopropylalkohol für 10 Minuten, um Ablagerungen zu entfernen beschallt. </li><li> Arrays von 2,5 um Höhenrücken Strukturen sind auf einem 50,8 mm x 50,8 mm Glasplatte mit einem Standard-Photolithographie-Prozess, durch Nassätzen des Glases folgt strukturiert. Zunächst werden Reihe von Bergrücken Strukturen auf einem gereinigten Glassubstrat mit Positivphotoresist S1818 mit Photolithographie. S1818 ist auf dem Substrat (4000 rpm), weiche Basis bei 110 Spin-Coating ° C für 5 min und dann mit UV-Licht (84 mJ / cm 2) mit einem Mask Aligner durch die Entwicklung der Photoresist in MF319 für 40, gefolgt Sekunden. Als nächstes wird der Fotolack gemusterten Glassubstrat in gepufferten Oxidätzung (BOE) bei Raumtemperatur für 6-7 Minuten eingetaucht, um einen 2,5 um groß Grat Strukturen zu erhalten. Schließlich ist der Photoresistschicht durch Aceton und Isopropylalkohol entfernt, gefolgt von gründlichem Spülen in deionisiertem Wasser (DI). </li><li> Glassubstrat mit Mikro-Grat Strukturen heißgeprägtem gegen die PMMA Meister seine Muster zu übertragen. Erstens sind PMMA Form beherrschen und Glassubstraten manuell ausgerichtet und auf eine hot-drücken. Dann ist die Temperatur auf 115 ° C erhöht Sobald die gewünschte Temperatur erreicht ist, 0,5 Tonnen Gewicht für 5 Minuten angewendet wird. Nach 5 Minuten ist die Temperatur auf 40 ° C und einem Druck freigegeben wird gekühlt. Die PMMA-Master ist dann in ein 50,8 mm x 50,8 mm Größe Block geschnitten. </li><li> 1 Gew.: PDMS pre-Polymer (Sylgard 184) ist mit Härter im Verhältnis von 10 gemischt. </li><li> PMMA-Master befindet sich in einem Fass und PDMS-Mischung ist auf der Oberseite des PMMA Meister gegossen, um ein PDMS Master herzustellen platziert. Es ist dann in einem Exsikkator an eine Vakuum-Pumpe. PDMS gegossen oben auf PMMA-Master ist dann für 15 Minuten entgast, um Luftblasen während des PDMS Mischvorgang erzeugt entfernen. </li><li> Wenn alle Luftblasen entfernt sind, ist PDMS in einem eingeebnet 85 ° C Ofen für eine Stunde zur Polymerisation gebracht. </li><li> Sobald PDMS vollständig ausgehärtet ist, wird PDMS Meister aus dem PMMA Master geschält und in einen Exsikkator mit 2-3 Tropfen von Trichlorsilan und abgesaugt werden für 15 Minuten in Dampf Mantel der PDMS-Master Oberfläche. Trichlorsilan-Beschichtung erleichtert die Veröffentlichung der finalen PDMS Neuron Co-Kultur-Geräte aus der PDMS-Master. Nach der Beschichtung wird die PDMS-Master kurz mit Isopropylalkohol gespült, um übermäßige Trichlorsilan zu entfernen, und trocknet sie mit N 2-Gas. </li></ol> Teil 2: Neuron Kultur Gerät Replikation <ol><li> 1 Gew.: PDMS pre-Polymer (Sylgard 184) ist mit Härter im Verhältnis von 10 gemischt. </li><li> PDMS-Mischung ist auf der Oberseite des PDMS Meister gegossen und entgast in einem Exsikkator an eine Vakuum-Pumpe für 15 Minuten. Es ist wichtig, nicht zu viel PDMS so pour dass die 3,5 mm hohen PDMS-Struktur auf dem Master nicht vollständig eingetaucht. </li><li> Wenn alle Luftblasen entfernt sind, ist PDMS in einem eingeebnet 85 ° C Ofen für eine Stunde zur Polymerisation gebracht. </li><li> PDMS wird aus dem Ofen nach einer Stunde entnommen und bei Raumtemperatur stehen gelassen, um abzukühlen. Dann werden PDMS Neuron Kultur-Geräte vorsichtig aus dem PDMS Master abgelöst. Abgeschält PDMS-Geräte sind mit Parafilm umwickelt, um sie vor Staub oder Schmutz zu schützen. </li><li> PDMS-Geräte, mit Parafilm umwickelt, sind in einzelne Stücke mit einer Bohrmaschine mit einem Messer ausgerüstet geschnitten. </li></ol> Teil 3: Device Montage <ol><li> PDMS Neuron Kultur Gerät ist im Plasma Reiniger gelegt und die Luft-Plasma für 90 Sekunden, um die Oberfläche des PDMS Gerät hydrophil. Dieser Plasma-Behandlung erleichtert Mikrokanäle mit Kulturmedien nach der Montage zu Poly-D-Lysin beschichteten Substrat gefüllt werden. </li><li> Geräte mit Plasma behandelt werden anschließend in 70% Ethanol für 30 Minuten für die Sterilisation eingetaucht und bewegt im Inneren des sterilisiert bio-Haube. </li><li> Sterilisiert Geräte sind aus 70% Ethanol aufgenommen und trocknet sie mit Millipore gefiltert N 2-Gas. Getrocknete Geräte sind auf der Oberseite des Poly-D-Lysin beschichteten Polystyrol gelegt 6-well-Kulturplatte und sanften Druck ausgeübt wird, um die Dichtung zwischen dem Substrat und das Gerät zu gewährleisten. </li><li> Kulturmedien wird dann in den Soma-Fach gefüllt, gefolgt durch das Ausfüllen der sechs Axon / Glia Fächern. Es ist besser zu geben 1-2 Minuten Pause vor dem Befüllen Axon / Glia Fächer nach der Zugabe von Nährmedien in die Soma-Fach, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Mikrokanälen gefangen sind. </li><li> Geräte mit Nährmedien gefüllt ist innerhalb eines 37 ° C Inkubator über Nacht um eventuelle Fremdkörper oder giftige Rückstände abspülen inkubiert. </li></ol> Teil 4: Cell Be-und Neuronen-Oligodendrozyten-Co-Kultur <ol><li> Am ersten Tag der Zellkultur, primäre Vorderhirn Nervenzellen aus Embryonaltag 16-18 Ratten werden in der Soma Fach an einer Flächendichte von 500 Zellen / mm 2 geladen. Erstens sind Kulturmedien innen sowohl das Soma-Fach und Axon / Glia Fächern abgesaugt mit Pipette vor Zelle geladen. Dann werden 38.500 Zellen in 40 ul von Kulturmedien verdünnt, um die Soma-Fach auf der ganzen Mikrokanal Buchten geladen. Es ist wichtig, nicht auf die PDMS-Gerät berühren, während das Laden der Zellen, da es die Dichtung zwischen dem Gerät und dem Substrat kann brechen. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen geladen werden Geräte für 30 Minuten innerhalb eines 37 ° C Inkubator für Zell-Adhäsion auf dem Substrat zu verbessern. Nach der Inkubation werden alle Fächer mit Nährmedien gefüllt. </li><li> Die Zellen werden bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator und nur die Hälfte von Nährmedien erfolgt alle 3-4 Tage gewechselt. </li><li> Nach 14 Tagen des Neurons Kultur in vitro, sind Oligodendrozyten, die Axone / Glia Fächer für Co-Kultur hinzugefügt. Oligodendrozyten, aus der zerebralen Hemisphären des Sprague-Dawley Ratten bei postnatalen Tag 1-2 seziert werden, um jedes Axon / Glia Fach auf einer Fläche Dichte von 1000 Zellen / mm 2 aufgenommen. Vor dem Laden Zellen sind etwa 60% der Kulturmedien in den Fächern mit Pipette angesaugt wird. Vorsicht muss nicht auf den Boden berühren Substrat sein, da es die axonale Netzwerk auf dem Substrat gebildet beschädigen können. Dann werden 6700 Oligodendrozyten Zellen, in 5 ul von Kulturmedien verdünnt, um das Axon / Glia Fächer aufgenommen. Die Zellen werden für 1 Stunde inkubiert und Fächer sind mit Nährmedien gefüllt. </li><li> Die Zellen werden bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator und nur die Hälfte von Nährmedien erfolgt alle 3-4 Tage für zwei weitere Wochen geändert. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Wenn Experimente ordnungsgemäß durchgeführt werden, Nervenzellen geladen, um die Soma-Fach zu schließen, um Mikrokanal Buchten und axonalen Schicht lokalisieren beginnen im Inneren des Axons / Glia Fächer bilden nach 1 Woche der Kultur. Sign of Neuronzelle Aggregation in der Soma-Fach kann ein Indiz dafür, dass Zellen nicht gesund sein. Beim Laden von Oligodendrozyten nach zwei Wochen Neuron Kultur, Axon / Glia Fächer sollten mit dichten Schicht von Axonen und Oligodendrozyten bedeckt sein sollte auf der Oberseite des axonalen Schicht geladen werden. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellungen der High-Throughput-Mikrofluidik Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron Co-Kultur-Plattform. Cross-Querschnittsansicht Isolation der Axone von Nervenzellen Soma und Dendriten sowie fluidische Trennung zwischen Abteilen mit winzigen fluidische Höhenunterschied. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Fertigungs-und Montageschritte für die Multi-Kompartiment-PDMS mikrofluidischen Co-Kultur-Gerät. Jedes Gerät passt in eine Vertiefung einer konventionellen 6-well Polystyrol Zellkulturplatte. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

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	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir haben eine multi-Fach Co-Kultur-Plattform für das Studium Säuger-ZNS Axon-Glia-Interaktionen entwickelt. ZNS Axone wurden erfolgreich von neuronalen Zellkörpern / Dendriten isoliert und Oligodendrozyten wurden erfolgreich im Inneren des Gerätes co-kultiviert. Neuron Dichte kann von Anwendungen verändert werden, sondern zu niedrige oder zu hohe Konzentration kann dazu führen, Zellen zu sterben. Auch ist es wichtig, nur die Hälfte von Nährmedien, so dass die Zellen oder axonalen Schicht auf dem Substrat nicht ...

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

Wir präsentieren ein neuartiges Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung, leiten kann bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel zur höheren Durchsatz. Wir entwickelten ein neues Herstellungsverfahren für Mikrofluidik-Geräte, die sowohl Mikro-und Makroebene Strukturen innerhalb des gleichen Geräts über einen einzigen Soft-Lithographie-Prozess zu schaffen, damit Massenfertigung mit guter Reproduzierbarkeit. Die Multi-Kompartiment-mikrofluidischen Co-Kultur-Plattform besteht aus einem Soma Fach für Neuronen und sechs Axon / Glia Fächer für Oligodendrozyten (OLS) zusammen. Die Soma-Fach und Axon / Glia Kammern sind durch Anordnungen von angeschlossenen Axon-Führung Mikrokanäle, die als physische Barrieren zu neuronalen Soma in Soma Fach beschränken, während gleichzeitig Axone in Axon / Glia Fächer wachsen. OLs in Axon / Glia Fächer geladen werden können nur interagieren mit Axonen, aber nicht mit neuronalen Soma oder Dendriten, so dass lokalisierte Axon-Glia-Interaktion Studien. Die Mikrokanäle ebenfalls aktiviert fluidische Trennung zwischen Fächern, so dass sechs unabhängige Experimente auf einem einzigen Gerät für höheren Durchsatz durchgeführt werden. Soft-Lithographie mit Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) ist eine häufig verwendete Technik in der biomedizinischen Bauelemente. Reservoirs auf diesen Geräten werden üblicherweise durch manuelles Stanzen definiert. Obwohl einfach, schlechte Ausrichtung und zeitaufwendig Natur des Prozesses macht diesen Prozess nicht geeignet, wenn eine große Anzahl von Stauseen immer wieder geschaffen werden müssen. Die neu entwickelte Methode nicht erforderlich manuelles Stanzen von Stauseen, die Überwindung dieser Beschränkungen. Erste, sieben Stauseen (Tiefe: 3,5 mm) wurden auf einem Poly (Methylmethacrylat) (PMMA)-Block mit einem Mikro-Fräsmaschine hergestellt. Dann wurden Arrays von Grat Mikrostrukturen auf einem Glassubstrat hergestellt, heißgeprägtem gegen den PMMA-Block, um Mikrokanäle, dass die Soma und Axon / Glia Fächer verbinden zu definieren. Dieser Prozess führte in Makro-Reservoirs (3,5 mm) und Mikro-Maßstab Kanäle (2,5 um) innerhalb eines einzigen PMMA Master übereinstimmen. Ein PDMS Replikat, das als eine Form Meister serviert wurde unter Verwendung von Soft-Lithographie und die endgültige PDMS Gerät wurde von diesem Master repliziert. Primäre Neuronen aus E16-18 Ratten wurden auf die Soma-Fach geladen und kultiviert für zwei Wochen. Nach einer Woche der Zellkultur, überquerte Axone Mikrokanäle und bildete axonalen nur Netzwerk-Layer innerhalb Axon / Glia Fächern. Axone wuchsen gleichmäßig über sechs Axon / Glia Fächer und OLS aus P1-2 Ratten wurden Axon / Glia Fächern an 14 Tagen in vitro für Co-Kultur hinzugefügt.

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A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Aufrufe.  Texas A&M University (TAMU). Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.

Serie: A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Forschung

Biologie

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Die Mikrofluidik-Probe: Betrieb und Nutzung für lokalisierte Oberflächenbearbeitung

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Ein Multi-Parametric Islet Perifusion System innerhalb eines mikrofluidischen Perifusion Geräte

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

Geändert ES / OP9 Co-Kultur-Protokoll bietet eine verbesserte Charakterisierung von hämatopoetischen Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...