Dieses Material ist auf der Arbeit von der National Science Foundation unter Grant No 0842736 unterstützt werden.

Einführung in die Novel GFS-Konfiguration Die GFS besteht aus mehreren wesentlichen Komponenten: Eine regelmäßige Lichtmikroskop, eine Montierung, eine Kamera und einen Computer [Abb. 1]. Die versiegelten Flow-Zelle Kammer, die die Probe hält, ist auch nach der GFS-Design unverzichtbar. Das Licht-Mikroskop wird auf die Montierung angebracht, so der Umfang gedreht werden kann, in verschiedene Orientierungen im Raum. Diese Fähigkeit ermöglicht die statische Vektor der Schwerkraft zu nutzen, so dass die Proben können dynamisch orientierte in Bezug auf den Vektor so die Schwerkraft kann Pikonewton-Bereich Kraftbelastungen, um die Proben zu verleihen. Die Kamera ersetzt das Lichtmikroskop der Augenlinse so dass es Veränderungen in der Orientierung der Probe aufzeichnen kann. Diese Rohdaten werden digitalisiert und manipuliert durch den Computer, um die Daten in tatsächliche Gewalt und Abstandsmessungen zu interpretieren. Die versiegelten flow-Kammer ist so konstruiert, um alle Freiheitsgrade im Raum ohne Probenverlust ermöglichen. In der Kammer befindet sich die Probe-Molekül, das in der Nähe eines Terminus mit einem &quot;Anker&quot; bead, dass die Oberfläche der Kammer geklebt ist angebunden. Das Gegenteil Terminus ist eine &quot;mobile&quot; Perle, die frei von der Oberfläche der Kammer gebunden. Es ist diese mobile Perle, frei in der Assay-Puffer, die auf durch die Schwerkraft gehandelt werden kann, dabei die angebundenen Moleküle bei so niedrigen Kraftbelastungen [Abb. 2]. Die Probe sieht einfach wie ein Paar von Mikrosphären unter dem Mikroskop, obwohl es einige Erfahrung dauert eine gute brauchbare Paaren, die durch ihre Bindung an ein Molekül aus Paaren, wo beide Perlen auf der Oberfläche des flow-Kammer sitzen gekoppelt sind zu erkennen. Eine Änderung des Systems ist die Zugabe von einer schwimmenden Plattform, die die GFS hält und wird durch Federn aufgehängt. In dieser Konfiguration, wenn die Probe wurde in eine Position gedreht, wo die Schwerkraft auf die Probe einwirken können, kann die Plattform mit all seinen Komponenten gegen die Federkonstante fallen gelassen werden. Nähe freien Fall, ist die Kraft, die auf dem mobilen Perle nahe Null und bei maximaler Ausdehnung der Federn &quot;, die Gravitationskraft ist so viel wie zwei multipliziert. Auf diese Weise kann eine abgestufte Kraft / Weg-Reaktion grafisch dargestellt, um das Verhalten eines einzelnen Moleküls in verschiedenen Kraftbelastungen messen. 1. Mikrosphärenpräparat <ol><li> Tauchen etwa 10 mg aus Glas oder Quarz Perlen in 0,04% 3-Aminopropyltriethoxysilan (Schnitt mit Aceton) für zwei Minuten. </li><li> Spülen Sie mit zwei Änderungen doppelt destilliertem Wasser und Zentrifuge Pellet bei 2000 xg für 5 Minuten. Überstand. </li><li> 5 ml Bindungspuffer (0,01 M Pyridin mit doppelt destilliertem Wasser geschnitten und pH-Wert auf 6,0), und schütteln Sie diese Mischung kräftig. Centrifuge wie oben beschrieben. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Um nasse Kuchen von Perlen, 2 mL 5% Glutaraldehyd-Lösung (cut Glutaraldehyd mit Kupplungspuffer). Kräftig schütteln. </li><li> Unter einer Haube, drehen Raupe / Glutaraldehyd-Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Centrifuge wie oben und saugen Sie den Überstand. </li><li> Waschen Sie die Kugeln in 5 ml Bindungspuffer durch Schütteln sie energisch und Zentrifuge und saugen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen noch dreimal. </li><li> Fügen Sie etwa 15 ul des gewünschten Antikörpers, um Perlen und kräftig schütteln. Die Perlen sollten gedreht 16-24 Stunden sein. </li><li> Unter der Haube, mit 5 ml 1 M Glycin Abschrecken Lösung (cut Glycin mit doppelt destilliertem Wasser und pH-Wert auf 7,0). Schütteln Sie dieses Gemisch kräftig und drehen für 30 Minuten. </li><li> Zentrifuge und saugen Sie den Überstand. </li><li> 5 ml Waschpuffer (0,01 M Tris, pH 7,0, 0,1% Natriumazid, 0,1% BSA; 0,15 M NaCl und 0,001 M EDTA). Schütteln Sie diese kräftig, Zentrifuge und saugen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal wiederholen. </li><li> Ändern Puffer mit niedrigem Salz-Puffer (0,1 M KCl, 0,02 M Imidazol, 5 mM MgCl 2, auf pH 7,0). Dreimal wiederholen. </li></ol> 2. Beispiel Anlage zum Microspheres <ol><li> Nehmen Sie eine kleine Menge des vorbereiteten Beads (ca. 2 ul von jedem Kuchen von Perlen aber, wenn es eine große Diskrepanz im Durchmesser zwischen den Chargen, ist es vorteilhaft, um einen 8:1-Verhältnis von großen zu kleinen Kügelchen zu verwenden) und fügen Sie sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Assay-Puffer. Reduzieren Sie die Konzentration Ihrer Protein auf rund 5 uM, mit dem Assay-Puffer. Bereiten Sie mindestens ein Gesamtvolumen von 400 ul einschließlich der Puffer, das Protein, und die Perlen. </li><li> Drehen Sie diese Mischung bei etwa 1 RPM für 3 Stunden (wenn das Protein zu viel bewegt wird, wird es zu aggregieren und unbrauchbar). </li></ol> 3. Slide Chamber Vorbereitung <ol><li> Coat eine dicke Objektträger mit 0,01% Nitrocellulose (in Amylacetat). Lassen Sie dieses Bild trocken für etwa 10 Minuten. </li><li> Mit einem scharfen Glasschneider, schneiden Deckglas, so dass eine Kammer zu machen. Dies erfordert vier Streifen von Glas. </li><li> Verwenden Sie die Tatsache,Theorie Rand des Glases und Harke es über ein Abstrich von Vakuum-Fett auf beiden Seiten der Kante. </li><li> Drücken Sie Fett beschichteten Streifen auf getrocknete Nitrocellulose überdachte Rutschbahn, um ein Feld auf der Oberfläche der Folie zu erstellen. </li><li> Pipette ca. 2 ul der Raupe / Proteinmischung, indem Pipette auf die Oberfläche des Glases in der Box. </li><li> Fügen Sie über 20-400 ul der salzarmen Puffer je nachdem wie groß der Kammer ist. </li><li> Drücken Sie ein Deckglas auf dem Feld, die bereits mit Vakuum-Fett beschichtet, um die versiegelte und gepuffert Kammer zu beenden. </li><li> Lassen Sie gleiten auf einem ebenen Platz sitzen, so dass die Perlen reichlich Zeit, sich an die Nitrozellulose Anker haben. </li></ol> 4. GFS Data Acquisition <ol><li> Montieren Sie gleiten auf GFS Bühne </li><li> Monitor, was die GFS Kamera die Aufnahme und die Suche nach legitim ist &quot;Perle Paare&quot;, in denen die kleinen Mikrosphären in der Nähe des Äquators der großen Mikrosphären verbunden ist. </li><li> Wenn ein potentieller bead Paar gefunden wird, durch die Tiefenschärfe zu gehen, um festzustellen, ob die &quot;mobile&quot; Perle nicht ruht auf der Oberfläche der Folie. </li><li> Sobald ein geeignetes Paar identifiziert wird, wird zur Kenntnis Winkel mobilen Wulst weg von d max (d max = der maximale Abstand zwischen den Schwerpunkten der gekoppelten Mikrosphären). Bewegen Sie den Rahmen in die richtige Position, um Video zu erwerben. </li><li> Der Winkel der Verfahrweg des GFS sollte ausreichen, um d min, d max und d min, die für 25-90 Grad, abhängig von der Länge des Moleküls nennen könnte aufzunehmen. </li><li> RECORD wie das Paar reist von d min auf d max und zurück nach d min. </li><li> Es ist eine gute Idee, auch einen Film drehen des Hintergrunds so kann er später für die Analyse abgezogen werden. </li><li> Wenn der Durchführung einer GFS Drop verschieben Sie den Rahmen wieder auf d max und notieren Sie die Tropfen bei mindestens 60 Bildern pro Sekunde. Der kritische Teil ist die erste Schwingung, aber lange Aufnahmezeiten können auch für dynamische Untersuchung verwendet werden. </li></ol> 5. GFS Data Analysis <ol><li> Transform raw video in digital &quot;Schwellenwert&quot; Bild-und Makro ausführen in ImageJ zum Zentroid Position jedes Kügelchen in jedem Frame des Videos zu bestimmen. Dies gilt auch für den Rückgang Video. </li><li> Dump der X-, Y-und Area-Data aus ImageJ in Excel und die Punkte. </li><li> Wenn eine richtige Perle Paar von Video erworben wurde, ist ein deutlicher Buckel in der Grafik bezeichnend für die Beads an ihren engsten (d min) und an der Spitze des Graphen ist die Position der d max. </li><li> Anhand dieser Daten soll der Radius jedes Kügelchen genau in ImageJ bestimmt werden und alle diese Informationen in die verschachtelte Gleichung ausgedrückt: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0,5 g = [d min 2 + r b 2 - (r a + r b) 2] 0,5 = r b sin β c = d max - r a - g (D = Abstand zwischen Schwerpunkte; g = Schwerkraft; α = Winkel in Grad parallel zu dem Objektiv; r b = Radius der mobilen bead; r a = Radius verankert Wulst, β = Winkel der Befestigung der Achse des Äquator der Verankerung Wulst. </li><li> Mit der angepassten Radius des mobilen Wulst, ergibt sich auch das Volumen, und angesichts der Dichte der Kugel, die Kraft des mobilen Perle verleiht dem Molekül kann in Pikonewton nach dem Auftrieb des Lösungsmittels berechnet werden subtrahiert. Bei dieser Methode wird die Kraft auf die angebundenen Moleküle in Pikonewton und berechnet die absolute Molekül Länge zwischen Antikörper-Anhänge in Nanometern. F = V (db) a (F = Kraft, V = Volumen, d = Dichte des Glases Mikrosphären, a = Beschleunigung aufgrund der Schwerkraft, b = die Dichte des verdrängten Wassers). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wenn die Raupe prep korrekt erfolgt ist, wird es mindestens Bead-Aggregation werden, obwohl es vielleicht noch ein gelegentlicher bead Klumpen werden. Wenn Sie über den Umfang gesehen sollte es eine vernünftige Verteilung der Perlen, ob repariert oder nicht in der Kammer sein. Es ist wichtig, um Vibrationen so weit wie möglich zu minimieren; diese entweder eine Luft-Tabelle zu tun, spezielle stoßdämpfende Füße für ein Stativ, dass ein EQ Montierung hält, oder auf dem System, Federn für Schwingungsisolierung eingesetzt werden kann nutzt. Ein weiterer nützlicher Tipp in Bezug auf die versiegelten Flusskammer zu lassen, für etwa fünf Minuten auf einem ebenen Tisch stand, nachdem es vollständig aufgebaut worden. Dies ermöglicht es jedem frei größere Perlen zu schweben nach unten durch den Puffer und Ruhe in der Schicht aus Nitrocellulose. Wenn die Folie wurden stattdessen direkt nach Fertigstellung montiert, würden die Ermittler immer wieder müssen mit Perlen buchstäblich fliegen durch das Sichtfeld viel, und wenn dies geschieht, während der Video-Erfassung kann th korruptene Experiment. Wenn dies richtig gemacht wird, bead Flug deutlich minimiert und sauberer Video Ergebnisse. Wenn ein potentieller bead Paar von der GFS-Operator identifiziert wird, ist es sinnvoll, sie durch eine vorläufige Rotation versetzt, um das Verhalten des Paares zu überwachen. Selten ist die große Perle nicht fest mit der Folie angebracht. Wenn dies geschieht, gibt es keine Verwendung bei der Nutzung des Paares, weil es entscheidend, dass die größere Perle Aufenthalt in einer festen Position über die Dauer der Übernahme verankert ist. Wenn das Paar ist stabil und weist keine &quot;verankert Wulst rollen,&quot; dann ist es geeignet für Experimente. Ein Grundstück von bead Abstände gegen Änderung des Winkels relativ zur Schwerkraft kann verwendet werden, um die gewonnenen Daten auszuwerten. Ein gutes repräsentatives Ergebnis würde wenig Trennung auf einem Plateau zu zeigen und als mobile Raupe löst sich aus der Verankerung Perle, weil der Einfluss der Schwerkraft, die Grafik wird eine stärkere Trennung zeigen. Dies wird fortgesetzt, bis ein schöner Gipfel ist erreicht, als d max ist und die Kurve beginnt wieder nach unten zurück zur Grundlinie d min [Abb. 1]. Unter idealen Bedingungen ist diese Signatur symmetrisch. Ein nicht repräsentatives Ergebnis würde zeigen, ein Diagramm mit unzusammenhängenden Muster zeigt keine deutliche d min-d max-d min Muster, oder wäre es Trennungen, die Größenordnungen zu hoch für ein einzelnes Molekül angibt, vielleicht sind zeigen, dass es war ein Stück von Staub zwischen die Perlen, oder vielleicht, dass das mobile Perle war einfach nicht angebracht überhaupt. Der Prozess des Findens des Paares, Schießen es, zu verarbeiten und zu analysieren hat es viele Stop Lücken, wo falsche Perle Paare gekeult out sind. Also, wenn Sie an das Ende des gesamten Prozesses zu bekommen und Sie haben ein Molekül Länge, die im Einklang mit früheren Ergebnissen ist, kann man sehr zuversichtlich, dass die ursprüngliche Raupe Paar repräsentativ ist und kann in den Ergebnissen enthalten sein. An einem guten Tag können etwa die Hälfte der Raupe Paare Schuss durch genommen werden, um eine legitime Datenpunkt werden. Zum Beispiel ist die Länge der Coiled-Coil von Myosin zwischen MF20 und MF30-Antikörper, basierend auf EM-Daten und AFM-, Daten zu 100 nm 2,7,8,9-Ansatz bekannt. Wenn das Ergebnis ist um ein Vielfaches dieser Länge muss die Probe zusammengefasst. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind aus Standard-GFS-Rotation Experimente und zeigen einen Abstand von 96 nm ± 5 nm, [Abb. 2], die eng stimmt mit den Messungen der MF30 (bindet an den N-Terminus von Myosin Subfragment-2) und MF20 (bindet in das Licht meromyosin) Antikörper Abstand auf Myosin aus der Literatur nicht ableiten [Abbildung 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. GFS-Konfiguration. Wesentliche Teile des GFS gekennzeichnet sind. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des GFS-Prinzip. Die linke Seite zeigt Schwerpunkt der mobilen Raupe mit einem Mindestabstand von Zentroid verankert Wulst. Als GFS gedreht wird, richtet mobilen Perle mit Vektor der Schwerkraft, die auch läuft parallel mit der Achse des angebundenen Molekül. In dieser Position ist der Abstand zwischen den Schwerpunkten der mobilen und verankert Perlen auf ein Maximum. Oben rechts zeigt eine repräsentative Scheibe aus einem GFS Film. Unten rechts ist ein Bild von der GFS unterziehen Rotation. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3 repräsentatives Ergebnis zeigt d min auf der linken Seite des Diagramms;. D max bei einer relativen Trennung von 17,78 Mikrometer und eine Rückkehr zu d min rund um die Grundlinie von rund 17,75 Mikrometer relativen Abstand zwischen den Perlen. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Repräsentatives Ergebnis der GFS-Rotation Experiment zeigt Abstand zwischen MF20 und MF30-Antikörper durchschnittlich 96 nm. Dies stellt die ungefähre Länge von S2. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Myosin II-Dimer verwendet werden, um eventuellen Anlagen für den Einsatz mit GFS einschließlich Antikörper und / oder Aktin-Anhänge zu zeigen. Verschiedene Befestigungsmöglichkeiten ermöglicht unterschiedliche GFS Strategien verschiedenen Regionen zu messen, oder um Kraft senkrecht an oder parallel zum Stab Domäne des Myosin-Dimer.

<ol>
	<li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure.">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li><li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin.">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li><li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers.">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li><li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin's+50+kDa+cleft.">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li><li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+manipulating+individual+protein.">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li><li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments:+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin.">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li><li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment.">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li><li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer.">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li><li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface.">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li><li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy.">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li></ol>

Bei der Konvertierung eines Films auf einem digital Schwellenwert Darstellung, ist es entscheidend für den Schwellenwert Bild, um die gleiche Fläche in jedem Frame des Videos zu erhalten. Da die Kügelchen in eine Perle Paar unabhängig voneinander bewegen, kann eine Drift in den Schwellenwert Bereichen auch dazu führen, die relativen Abstände zwischen den Schwerpunkten der Perlen zu treiben und führen zu signifikanten Fehler. Controlling der Schwelle Bereich reduziert den Fehler das Fünffache in die Abstandsmessu...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

Das Studium der makromolekularen Struktur hat sich kritisch zur Aufklärung der molekularen Mechanismen und Funktion. Es gibt mehrere begrenzte, aber wichtige Bioinstrumente der Lage, die Prüfung der Kraft Abhängigkeit der strukturellen Merkmale in Proteine. Skala hat eine Begrenzung der Parameter, wie genau können die Forscher in den nanomechanischen Welt der Moleküle, wie Nukleinsäuren, Enzymen und Motor-Proteine, die lebenserhaltende Arbeit zu verrichten Peer worden. Atomic Force Microscopy (AFM) ist gut abgestimmt, um einheimische Strukturen Faserproteinen mit einem Abstand Auflösung auf Augenhöhe mit der Elektronenmikroskopie bestimmen. Doch in AFM-Studien sind die Kräfte in der Regel viel höher als ein einzelnes Molekül kann 1, 2 zu erleben. Optische Fallen (OT) sind sehr gut auf die Bestimmung der relative Abstand zwischen den eingeschlossenen Perlen, und sie verleihen können sehr kleine Forces 3. Allerdings stehen sie nicht nachgeben genaue absolute Länge der Moleküle unter-Studie. Molekulare Simulationen liefern unterstützende Informationen für solche Experimente, sondern in der Fähigkeit, die gleichen großen molekularen Größen, lange Zeiträume, Griff und überzeugen einige Forscher in Ermangelung anderer Belege 2, 4 begrenzt. Die Gravitationskraft Spektrometer (GFS) füllt eine kritische Nische in das Arsenal der Ermittler durch eine einzigartige Kombination von Fähigkeiten. Dieses Instrument ist in der Lage Kräfte in der Regel mit 98% oder eine höhere Genauigkeit bei der femtonewton Bereich der Nanonewton Bereich. Die Abstandsmessungen derzeit sind in der Lage die Lösung der absolute molekulare Länge bis fünf Nanometer, und die relative bead Paar Abstände mit einer Genauigkeit vergleichbar mit einer optischen Falle. Außerdem kann die GFS bestimmen Dehnung oder Abwickeln, wo die Kraft der Nähe des Gleichgewichts ist, oder eine abgestufte Kraft gegen jede gemessene strukturelle Veränderungen gegenüberzustellen. Es ist sogar möglich, festzustellen, wie viele Aminosäuren sind in Abwickeln Veranstaltungen unter physiologischen Kraftbelastungen 2 beteiligt. Im Gegensatz zu anderen Methoden, wo es umfangreiche Kraftkalibrierung, dass alle Tests vorausgehen muss, erfordert die GFS keine solche Kraft Kalibrierung 5. Durch die Ergänzung der Stärken des anderen Methoden wird die GFS Lücken im Verständnis der Nanomechanik lebenswichtiger Proteine ​​und andere Makromoleküle zu überbrücken.

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins at JoVE.com

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zeigt den Zweck, den Betrieb und repräsentative Ergebnisse aus dem Roman Gravitationskraft Spektrometer.

Demonstration der Verwendung des neuartigen Gravitationskraft Spectrometer auf Stretch and Measure Faserproteinen

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Aufrufe.  University of North Texas. Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zeigt den Zweck, den Betrieb und repräsentative Ergebnisse aus dem Roman Gravitationskraft Spektrometer.

Serie: Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In-situ-Druckbelastung und Correlative Nichtinvasive Bildgebung des Knochen parodontalen Ligament-Zahn-Faser-Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

High Speed ​​Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...